牛奶中青霉素残留检测方法——酶联免疫吸附测定.doc

目 次 前言 II 1 范围 3 2 规范性引用文件 3 3 制样 3 3.1 样品的制备 3 3.2 样品的保存 3 4 测定方法 3 4.1 方法提要或原理 3 4.2 试剂和材料 3 4.3 仪器和设备 4 4.4 测定步骤 4 4.5 结果计算和表述 4 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 5 5.1 灵敏度 5 5.2 准确度 5 5.3 精密度 5 前 言 本标准按GB/T1.1—2000 《标准的结构和编写规则》进行编制 本标准由四川省畜牧食品局提出并归口 本标准由四川省质量技术监督局批准 本标准起草单位：四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所 本标准主要起草人：杨松沛、岳秀英、 牛奶中青霉素残留检测方法－ 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 范围 本标准规定了残留检的制样和酶免疫法。。酶免疫法,其基本原理是抗原抗体反应。酶标板的微孔包被有偶联抗原，样品抗体通过洗涤除去抗体加入终止液，在450nm处测定吸光度值，吸光度值与试样中浓度反比。gNa2HPO4.12H2O和8.7gNaH2PO4.2H2O，用1000mL水溶解（pH=7.2）即可。 青霉素试剂盒（采用官方备案的试剂盒） 4.2.6.1 青霉素系列标准溶液(g/mL 、0.1(g/mL、0.3(g/ml、0.9(g/mL、2.7(g/mL、8.1(g/mL 4.2.6.2 酶标板 8条×12孔，包被有偶联抗原抗体底物液底物液终止溶液酶标仪（配备450nm滤光片）0.01g 分析天平 感量0.00001g 漩涡混合仪 振荡器 组织匀浆机 冷冻离心机 氮吹微量移液器 单道20(，50(，100(，1000(；多道250(L 测定步骤 试料的制备 试料的制备包括： 取混匀后的供试样品,作为供试试料。 取混匀后的空白样品,作为空白试料。 取混匀后空白样品,添加适宜浓度的标准溶液，作为空白添加试料。 提取和净化 精密量取1mL试料mL0.1moL/LPB缓冲液(pH=7.2)，充分混合后加入5mL正己烷振荡提取10min，于8000r/min15℃离心10min,取出下层液体50(L用于分析。 样品测定程序（20℃～26℃条件下操作） 4.4.3.1 使用前将试剂盒置于室温（2026℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于28℃。将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品均需做两个平行实验。 4.4.3.2 加50 (L标准溶液或试样溶液微孔，加入50(，用盖板膜封板，中反应min。倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体。每孔加入250(洗涤液，0s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次加入100(酶标记物微孔，用盖板膜封板，中反应30min。取出酶标板，如前述洗板5次。 加入50(底物液A50(L底物液B微孔，轻轻振荡混匀避光显色min。 4.4.3.6 加入50(终止液微孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值（OD值）。所获得的标准或样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）吸光度值的平均值再乘以100%，得到以百分比给出的吸光度值，以式（1.1）表示： 百分吸光度值= ×100% ……………………………………………………… 1.1 式中: B—为标准溶液或供试样的平均吸光度值； B0—为零浓度标准溶液的平均吸光度值。X轴为标准溶液中浓度((g/L)的自然对数，Y轴为百分吸光度值，在半对数坐标纸上绘制标准曲线图。(g/L）可以从标准曲线上查出。μg/L时，可判为未检出，大于μg/ L时，判为可疑，需用确证法确认。本方法的批内变异系数CV≤14.0%；批间变异系数CV≤15.0%。 NY ××××—×××× NY ××××—×××× 1 DB51/T 659—2007 DB51/T659—2007 II I 4 3 ICS：65.020.30 备案号： 四川省地方标准 DB DB51/T 659—2007 牛奶中青霉素残留检测方法－ 酶联免疫吸附测定(ELISA)法 Determination of Residues Penicillins in Milk by Enzyme-linked Immunosorbent Assay 2007-03-17发布 2007-05-01实施 四川省质量技术监督局 发布 B —— B0