DNS比色法测定还原糖及总糖.docVIP

还原糖和总糖的测定 (3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的 1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理 2、学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用 二、实验原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来对还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量以葡萄糖含量计。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 三、实验材料和试剂 1、实验材料面粉 2、实验试剂1mg/ml葡萄糖标准液 准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100m容量瓶中，用蒸馏水定容至100m，混匀，4℃冰箱中保存备用。 3,5-二硝基水杨酸DNS)试剂 将6.3g DNS和262m 2M NaOH溶液，加到500m含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000m，贮于棕色瓶中备用。 碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100m蒸馏水中。 酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250m 70%乙醇中。 6M HCl和6M NaOH各100m。 四、实验器材 具塞玻刻度试管：20m×11 大离心管：50m×2 烧杯：100m×1 三角瓶：100m×1 容量瓶：100m×3 刻度吸管：1m×1；2m×2；10m×1 恒温水浴锅 沸水浴 离心机 扭力天平 分光光度计 五、操作步骤 1、制作葡萄糖标准曲线 取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/m的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同葡萄糖反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 管 号 1mg/m葡萄糖标准液ml) 蒸馏水 ml) DNS (ml) 葡萄糖含量 mg) 光密度值 OD-540nm) 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸馏水至10m，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2、样品中还原糖和总糖的测定 还原糖的提取 准确称取3.00g食用面粉，放入100m烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后50ml蒸馏水搅匀，置50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液含沉淀转移到50m离心管中，于4000r/min离心5min，沉淀可用20m蒸馏水洗一次，再离心，将次离心的上清液收集在100m容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 总糖的水解和提取 准确称取1.00g食用面粉，放入100m三角瓶中，加15m蒸馏水及10m 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min用碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6/l NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100m容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10m，移入另一100m容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。 显色和比色 取4支具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。 表2 样品还原糖测定 管 号 还原糖待测液 （mL） 总糖待测液（mL） 蒸馏水 （mL） DNS （mL） 光密度值 （OD-540nm） 查曲线葡萄糖量（mg） 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 五、结果与计算 计算出7、8号管光密度值的