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重叠延伸PCR。(OE-PCR)这种方法运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突变类型的限制，利用OE-PCR不仅能实现基因点突变，还能便利地实现大片段的插入及删除。其基本原理如图1所示。 首先设计两PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段，随后将上述两个PCR 产物混合，二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因，对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率。OE-PCR不足之处在于：一个突变需要两对引物，3次PCR，并且需对中间产物进行纯化。相对而言步骤较烦琐，不经济；由于DNA二级结构及互补链的竞争等因素的影响，有时两个中间产物难于有效地相互结合，导致目的产物得率很低；当利用Taq聚合酶进行PCR反应时，经常在PCR产物末端加上腺苷酸，这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合，另一方面可能会插入基因中导致产生 非预期的移码突变。针对这些不足，后来许多学者对OE-PCR进行了改进。1997年，URBAN等提出一步重叠延伸PCR法，使得三个PCR反应得以在一个试管里进行，并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。其原理是首先将待突变的DNA以相反的方向克隆到两个载体中，这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同。这样便得到两个模板。将这两个模板，两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次PCR反应即可得到含突变的目的