一种基于单交换原理的地衣芽孢杆菌基因敲除方法及应用.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（１１）：６３６９ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 一种基于单交换原理的地衣芽孢杆菌 基因敲除方法及应用 韩海红　汪俊卿　王腾飞　肖　静　韩登兰　王瑞明 （齐鲁工业大学生物工程学院　济南　２５０３５３） 摘要　目的：基于同源单交换原理构建地衣芽孢杆菌基因快速敲除方法，提高基因敲除效率。方 法：以地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）２００８５内切纤维素酶基因ｃｅｌｂ为拟敲除对象，利用重叠 ｒ ＰＣＲ技术将ｃｅｌｂ基因内约５００ｂｐ片段与氯霉素抗性基因（Ｃｍ）相连接，经末端单酶切后电转化至 ｒ Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ２００８５感受态细胞中，仅通过一次同源单交换，将抗性基因Ｃｍ插入至ｃｅｌｂ基因内 部，实现目的基因的敲除。结果：经过氯霉素抗性筛选和基因组ＰＣＲ鉴定，成功获得ｃｅｌｂ基因缺 失菌株Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ２００８５ｃｅｌｂ；发酵验证结果显示，Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ２００８５ｃｅｌｂ较原始菌株滤 Δ Δ 纸崩解能力显著降低，其中发酵 ６０ｈ后 内切纤维素酶（ＣＭＣ酶）活力由 １．８６Ｕ／ｍｌ降低至 ０．５０Ｕ／ｍｌ，表明ｃｅｌｂ基因在地衣芽孢杆菌降解纤维素的过程中起着重要作用。结论：通过重叠 ＰＣＲ技术结合同源单交换原理能够实现地衣芽孢杆菌目的基因的快速敲除，为该菌株甚至其它 微生物提供了一种基因功能快速鉴定的手段。 关键词　地衣芽孢杆菌　同源单交换　基因敲除　ｃｅｌｂ基因 中图分类号　Ｑ７８ 　　地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）是一类在自 上下游两段基因序列作为同源臂，构建穿梭载体或自 然界广泛存在且能抵抗恶劣环境的革兰氏阳性嗜热 杀载体并转化到目的菌株中，转化后通过同源双交换 ［１３］ ［９］ 菌，在包括医药、饲料、纳米技术等领域 在内的生物 实现目标基因的敲除，如田李等 对构建含有 Ｖｄｋｕ８０ 技术领域具有重要的应用价值，同时研究还发现地衣 上下游同源臂、潮霉素抗性标记、遗传霉素抗性标记和 芽孢杆菌具有高效的纤维素、半纤维素和木质素降解 ｐＧＫＯ２Ｇａｔｅｗａｙ复制起始位点的敲除载体 ｐＫＯ２ ［４６］ ［７］ Ｖｄｋｕ８０，电转化至大丽轮枝菌中，最终实现Ｖｄｋｕ８０基因 酶系 ，在生物质材料降解方面也崭露头角 。目前 对地衣芽孢杆菌的研究主要集中在功能基因的克隆及 的敲除。虽然基于上述原理进行基因敲除的方法目前 ［８］ 已被广泛应用，但整体构建流程复杂、操作周期相对较 表达上 ，而关于地衣芽孢杆菌分子改造技术则鲜有 长［１０１１］，而通常以基因功能验证为目的基因敲除则需 报道。 要更为简便快速的基因敲除技术。 　　基因敲除（ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔ），又称为基因打靶，即利 　　本研究利用ＰＣＲ技术两步构建敲除片段，酶切后 用ＤＮＡ转化技术，将构建的打靶载体导入靶细胞后，