基因工程简明原理.pdf

Chapter 3 基因工程原理 克隆载体 真核基因的克隆 重组DNA 的筛选 外源基因的表达体系 DNA序列分析 PCR技术 反义技术 点突变 克隆载体 克隆载体的特性 复制起始(ORI) ：在受体细胞中独立复制； 多克隆位点(MCS) ：含多个限制性核酸内切酶 单一切点； 多选择标记：抗药性，其他遗传标记； 分子量小：能容纳的外源DNA片段尽可能大； 常用克隆载体 质粒, 噬菌体( λ), Cosmid, Phagemid, 真核病毒, YAC, BAC 质粒载体 质粒是染色体外的遗传物质可独立复制产生多个拷贝，Boyer和 Cohen于1973年构建了第一个重组质粒并在大肠杆菌中稳定传递。 质粒复制 ：松弛型－独立复制，拷贝数高, pUC载体可达700个/ 细胞；严紧型－受受体染色体DNA复制控制，拷贝数低。氯霉 素扩增－氯霉素可抑制染色体DNA复制，但质粒复制不受影 响，可增加拷贝数。 遗传标记：多数为抗药性标记，可进行抗药性筛选或插入失活 筛选。LacZ 的α互补－质粒含有lacZ基因的5’编码区(N端146个 氨基酸)并插入多克隆位点，染色体上为3’端顺序，两个亚基结 合才具有功能( α互补) ，插入外源片段后失去互补功能－可进 行蓝白菌落筛选(诱导物－IPTG 即异丙基- β-D-硫代半乳糖苷， 生色底物X-gal －5-溴-4-氯-3-吲哚- β-半乳糖苷) 。 噬菌体载体 λ噬菌体 λ噬菌体经过改造 去除中间非必需部分 可以插入大片段DNA 分子（约20Kb ）是构 建基因文库主要载体 之一。 包括Charon, λEMBL和λgt系列。 λgt 用于克隆cDNA片 段。 λ噬菌体 λ噬菌体颗粒 中为双链DNA分 子，感染宿主细胞 后由COS(12个核 苷酸互补单链粘性 末端)形成环状分 子，可进入溶源或 裂解生长周期。滚 环复制产生串联多 聚体，从COS位点 切下产生λ噬菌体 并包装进噬菌体颗 粒。 M13单链DNA噬菌体 M13噬菌体可以单链和复制型 双链形存在，克隆片段可以直接 进行序列测定，亦可以进行基因 点突变。 粘粒(Cosmid)和噬菌粒(Phagemid) Cosmid- λ噬菌体与质粒融合构建的载体，也称为粘 粒, 可以进行质粒的繁殖方式，亦可以用λ噬菌体 DNA 的COS位点像λ噬菌体一样进行包装并感染大 肠杆菌，可以克隆40~50Kb 的外源DNA片段。 Phagemid-质粒与M13噬菌体融合构建的载体，可以 进行质粒的复制及诱导进行M13噬菌体复制。包括 pUC118, pUC119等。 真核基因的克隆 人工合成基因 cDNA文库 基因组文库 PCR扩增(RT-PCR) DNA化学合成 根据已知基因的氨基酸序列设计适合受体细胞表达偏爱密码子 的核苷酸链，合成单链DNA片段，互补产生双链片段并有单链 末端，多个互补双链片段连接插入载体转化即获得合成基因的 克隆。 化学合成过程如下：DNA 自动合成仪(ABI) 去保护: 核苷固定在固相载体(硅胶等高分子)上，5’-OH 由 DMTr (二甲氧基三苯甲基)保护，三氯醋酸(TCA)去保护； 激活反应: 四唑激活下，核苷(N )与核苷(N )上的5’-OH 2 1 起偶联反应，用乙腈洗涤； 加帽反应: 醋酸酐与DMAP(二甲基氨基吡啶)作用下，使 未参加反应的寡核苷酸链乙酰化，不参加下一步反应；