大肠杆菌双杂交系统.pdfVIP

* 大肠杆菌双杂交系统 闫健斌 蔡伟康 江雪源 （南京大学医药生物技术国家重点实验室 南京 210093） E-mail : biosky@ 摘要： 大肠杆菌双杂交系统，作为一种新型的研究蛋白质相互作用的方法，近年来得到了 快速的发展。本文详细介绍了该系统的特点、原理及发展现状等。 关键词：双杂交 ，细菌 ，相互作用 大肠杆菌双杂交系统是继酵母双杂交系统[1] [2] 和哺乳动物细胞双杂交系统 之后，产生的 另一种直接于细胞内检测蛋白与蛋白相互作用的遗传学新方法。近几年来，该系统得到了飞 速的发展，逐渐走向成熟并运用到了许多领域。 1 特点和优点 虽然酵母双杂交系统近些年来得到广泛的应用和不断的改进。但其系统本身仍然还有一 些局限。然而大肠杆菌双杂交系统，在某些方面则具有了更大的优势。 第一、研究周期短，操作简单[3]。传统的酵母双杂交系统需要六天或更久才可得到结 果，而大肠杆菌双杂交系统只需不到一天的时间。另外，使用大肠杆菌双杂交系统时，分离 和扩增质粒都非常简单。第二，能够产生容量更大的文库。就目前的方法而言，酵母细胞的 转化效率只能达到 106cfu/μgDNA，而大肠杆菌细胞可达到 109cfu/μgDNA。第三，更低的 假阳性率和假阴性率[4]。大肠杆菌的遗传体系有更小的基因组复杂性，与高等真核生物相 比，又具有更大的进化距离。从而，避免了在研究真核生物蛋白相互作用时，由酵母内源蛋 白所引起的假阳性和假阴性现象。此外，一些真核的调控蛋白有可能对酵母细胞产生毒害， 而同样的情况发生在大肠杆菌中的可能性会小得多。而且，采用大肠杆菌作为筛选宿主，还 能够避免传统酵母双杂交系统对于核定位的要求。第四，更好的小分子药物筛选宿主。用酵 母双杂交系统进行小分子药物的筛选时，一个关键的局限因素在于药物对于酵母细胞膜的可 渗透性。然而，大肠杆菌细胞对于这些小分子药物的通透性要好得多[4]。 2 基本原理 与酵母双杂交的原理相似。通过将所要研究的蛋白质分别与 DNA 结合域（DBD）与活化 域（AD）融合，利用相互作用蛋白质提供的桥联功能，使活化域与 DNA结合域结合，从而调 控报告基因的表达。报告基因表达的调控结果可通过生化或遗传学的方法检测到。 3 建立 * 本课题得到国家自然科学基金资助（No.） - 1 - 大肠杆菌双杂交系统最初是由Karimova[5]等于1998年提出。该检测方法是根据百日咳 博代杆菌（Bordetella pertussis）中的腺苷酸环化酶（CyaA）催化的反应为基础建立的。 该腺苷酸环化酶催化cAMP的合成反应，其催化结构域可以分成T18和T25两个相对独立的功能 单位。将所要研究的蛋白质分别与T18和T25片断融合后，再导入大肠杆菌DHP1(cya-)菌株中， 如果待检蛋白质间能够相互作用，那么T18和T25片断就可借此结合到一起，催化形成cAMP。 合成的cAMP作为一个信号分子，可激活作为报告基因的乳糖或麦芽糖操纵子的表达，产生可 以识别的表型变化。 4 大肠杆菌双杂交系统的发展现状 到目前为止，已经建立了许多不同体系的大肠杆菌双杂交系统。根据其建立原理可分为 如下几类。 [4] 4.1 以λ阻遏蛋白为基础的检测系统 在λ噬菌体中，阻遏蛋白cI是以同型二聚体的 形式发挥作用的。其每个亚基由两个功能不同的区组成，N端具有与操纵区结合的功能，C 端则介导二聚体的形成。而且，一旦移除二聚体形成区就会明显降低DNA结合区与操纵区的 结合力