酵母单杂交报告基因.docVIP

酵母单杂交报告基因 ：酵母 杂交 基因 报告 酵母双杂交原理 酵母双杂交步骤 酵母双杂交系统 篇一：酵母单杂交技术 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术 (2013-03-23 05:24:00) 转载▼ 标签： 酵母单杂交 gal4蛋白 酵母双杂交技术 报告基因 文化 分类： 分子生物学专业 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术，是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析，来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对DNA结合位点进行分析。 运用此技术，能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列，而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白研究中，具有一定的优势；而且，酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果，比其他体外技术获得的结果，更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况。 1 酵母单杂交技术的原理 酵母单杂交技术，最早是1993年由Li et al 从酵母双杂交技术发展而来，酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检测以实现对蛋白质间相互作用的研究，而酵母单杂交技术则通过对报告基因的表型检测，分析DNA、蛋白之间的相互作用，以研究真核细胞内的基因表达调控。 目前认为真核生物的转录起始，需要转录因子的参与。这些转录因子通常由一个DNA特异性结合功能域和一个或多个与其他调控蛋白相互作用的激活功能域组成，即DNA结合结构域(DNA-binding domain, BD)和转录激活结构域(activation domain, AD)。 用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子。 研究表明GAL4的DNA结合结构域，靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS);而转录激活结构域，可与RNA聚合酶或转录因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。 在这一过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，我们可将GAL4的DNA结合结构域置换为其他蛋白，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录。 正是基于这一理论，酵母单杂交系统由2部分组成： (1)将文库蛋白片段，与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒； (2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒。 在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化入报告株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对报告基因的表达，将文库蛋白的基因筛选出来. 2 酵母单杂交技术的应用 酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在结构和功能上，是由独立的DNA结合结构域和DNA激活结构域组成的基础上，这使得研究者可以构建不同的基因融合体，在酵母中表达融合蛋白，以同时结合特异的目的基因和激活转录。 理论上，在酵母单杂交技术中，任何目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋白。 目前,酵母单杂交技术的应用可以归纳为以下二类: 2.1 鉴别DNA结合位点，并发现潜在的结合蛋白基因 目前对于酵母单杂交技术的应用主要体现在这些方面。 Chew et al 应用酵母单杂交技术证实了在大鼠脑中存在的COUP-TFⅠ、EAR2和NURR1等蛋白质，是GRIK5基因的内含子结合蛋白，从而进一步验证了多种核孤儿受体，可通过与内含子序列结合，发挥其调控神经递质受体基因作用的假设。 Wei et al 1999年运用此技术，确定了特异性结合于海胆胚胎孵化酶(SpHE)基因调控区域的反式激活因子SpEst4。 Sieweke et al 运用酵母单杂交技术对转录辅助因子进行了筛选。 Huang et al 为分离与人ε-珠蛋白基因上游沉默子片段相互作用的蛋白，运用酵母单杂交技术，利用人肝cDNA文库进行筛选，得到能与其结合的蛋白RPL3(ribosomal protein L3),并通过电泳迁移率变动实验(EMSA)和竞争抑制实验，证实其确有结合该沉默子活性,进而说明RPL3通过与人ε-珠蛋白基因上游沉默子结合，在胚胎阶段的沉默人ε-珠蛋白基因表达中扮演了重要角色。 Liao et al 于2002年运用酵母单杂交技术筛选出了能与大鼠谷胱甘肽S-转移酶(GST) P增强子GPEⅠ核心序列相互作用的转录因子，经对2个阳性克隆pYGPE1和pYGPE2的鉴定，发现pYGPE1的插入片段与大鼠原癌基因c-juncDNA具有99 %同源性，其编码的氨基酸残基序列与大鼠c-jun蛋白具有100 %同源性，pYGPE2的插入片段与大鼠线粒体腺苷酸转位酶cDNA具有9