免疫组化原理-201242.ppt

免疫组化的原理 免疫组化原理 免疫组化的原理 原理： 组织或细胞内的某种化学物质（待检测物） 抗原 免疫动物 抗体 检测（免疫组织化学） 荧光素 酶 金、银颗粒 三、免疫组化染色方法的类别 直接法 将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色，没有联结系统、未用桥抗体。 优点：特异性高、非特异染色轻。 缺点：敏感性低，要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记 间接法 将标记物标记在桥联抗体上（即二抗、三抗） 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体，其酶标抗体必须是针对兔 优点：敏感性高，只需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺点：特异性差 PAP法过氧化酶-抗过氧化酶法 组成： 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 二抗是联结抗体，一面联结一抗，另一面联结PAP复合物 三抗是以过氧化物酶为抗原，在与一抗同种动物身上诱发产生的抗体，并与辣根过氧化物酶形成复合物（PAP） PAP法（过氧化酶-抗过氧化酶法） 优点： PAP复合物中含酶更多，且是一种非标记的免疫组化方法，敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色，兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片 ABC法（亲和素-生物素法） 组成： 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素） 优点： 亲和素和生物素有强大亲和力，使其比直接和间接酶标法更敏感，也超过PAP法。 能用于常规石蜡切片。 LSAB（SP）法标记的链霉亲和素-生物素法 特点：将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点： 更快速：空间结构更小 更敏感：链霉亲和素的亲和性更强，更易于到达深部位点 非特异背景更少：链霉亲和素空间结构特殊，不易与高荷电的组织成分（胶原纤维、结缔组织）联结 酶标亲和素 在AB复合物中，酶是标记在生物素上，而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上，辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力，因此LSAB法比ABC法更敏感 一步法（EPOS）及两步法（Envision） 特点 以多聚体为载体，联结了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 优点 操作简便，省时 提高了敏感性和特异性 减少了背景着色 避免内源性生物素的干扰 多聚物载体 一步法及二步法载体试剂，可分别称DAKO EPOS及DAKO Envision试剂 核心是一种柔韧的多聚物，它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用 一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标记的多聚物 辣根过氧化酶的免疫组化染色的反应过程: HRP + H2O2 HRP?H2O2 有色分子终末产物 + HRP DAB（电子供体） HRP：酶 H2O2：底物 HRP?H2O2：酶?底物复合物 受氢体为过氧化氢； 供氢体较多包括DAB； 免疫组化原理及流程介绍 PBS的PH和离子强度的使用 免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色系统的差异： 间接酶标法：利用标记于桥联抗体的酶 PAP法： 利用PAP复合物 ABC法： 利用AB复合物 LSAB法: 利用直接标记于亲和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物载体 免疫组化原理及流程介绍 三 免疫组化的基本流程 免疫组化原理及流程介绍 一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。 一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关。一般37度1-2h，或4度过夜和从冰箱拿出后常温复温45min。 免疫组化原理及流程介绍 二抗孵育条件：二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索。 但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。 1, 盐酸酒精:使用浓度1% 36-38%盐酸：1ml 75%乙醇：99ml 2, 氨水：使用浓度为0.2% 25-28%:0.2ml 自来水:100ml 3，素木精染色原理