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实验四 兔抗SRBC免疫血清的纯化 抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分。 ??? 抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程。 粗提法主要常用硫酸铵盐析法 精制法分非特异性和特异性两种类型。 非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换 层析法，其方法均系基于蛋白质分子的物理性质。 特异性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗 体的特异性反应。 实验目的： 熟悉免疫血清纯化方法（盐析法）的原理 了解抗体的纯化方法（盐析法）和步骤 实验原理: 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析” 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： ? 溶解度大；分离效果好；不易引起变性； 价格便宜；废液不污染环境。 蛋白质由于分子质量和携带的电荷不同，可在不同浓度的高盐溶液内分级析出。 pH7: 50%饱和硫酸铵，可沉淀出所有类型Ig； 33%饱和硫酸铵，可沉淀出大部分分IgG； 40%饱和硫酸铵，沉淀最多，IgM和IgA增多。 实验用品： 饱和硫酸铵溶液(400g-500ml;70-80℃ 20min；趁 热过滤；浓氨水调pH至7.4;室温保存） 兔抗SRBC免疫血清 0.1mol/L、pH7.4磷酸盐缓冲液 （含0.2g/L叠氮钠） 生理盐水，蒸馏水 器材 离心机、紫外分光光度计、天平、磁力搅拌器、透析袋、烧杯、滴管等 实验方法: 1、盐析 2、透析除盐 3、蛋白含量测定 取一100ml烧杯： 10ml免疫血清＋10ml生理盐水 置于磁力搅拌器上，边搅拌边滴加入饱和硫酸铵20ml(至50％饱和度) 10000r/min, 4 0C离心10min，弃上清（含白蛋白）(50ml离心管) 沉淀（含βγ球蛋白）中加入20ml生理盐水溶解 滴加饱和硫酸铵10ml (至33％饱和度) 10000r/min离心10min，弃上清 （γ球蛋白析出） 静置30min 沉淀物中加4ml生理盐水,装入透析袋（除盐） 透析袋放入盛有蒸馏水的大烧杯中，4℃下透析4h 将烧杯中的蒸馏水换为生理盐水透析48h，其间反复换液数次. (以除去剩余硫酸铵) 将透析袋中样品收集到4个1.5ml管中 取一管,从中取少许做稀释，以紫外分光光度计测量蛋白量, 其余,置-20 ℃保存. 蛋白含量(mg/ml) =(1.45×OD280nm－0.74×OD260nm)×样品稀释度 实验结果: 测定并计算出蛋白含量。 讨论: 盐析沉淀免疫蛋白时，应该注意哪些问题？ γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。 * γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。 *