细胞培养的.pptVIP

* * * * * * 培 养 要 点 *合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%） 合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为37℃，20-40分钟） * 常 犯 的 错 误 水浴锅未预热 组织块太大 * 胰蛋白酶消化不足或过度 吹打用力过重 常 犯 的 错 误 * 4.3 传代培养和细胞系的维持 * 传 代 细 胞 培 养 细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。 63 * 首次传代注意事项 细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传代。 传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时处理。 首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。 63 * 细 胞 传 代 方 法 根据细胞生长的特点，传代方法有3种 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/2～2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代 半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液 64 * 贴壁生长细胞传代方法 吸光培养瓶中的培养液 PBS洗一次 加入1～2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置2～10 min（显微镜下动态监测） 吸去胰蛋白酶液，加入培养液 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液 吸取1/10～1/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内 将后者放入培养箱中培养 * * * Trypsin消化细胞 未消化细胞 细胞消化过程 * * * 培 养 要 点 严格的无菌操作 适度消化 * 细胞培养中需要注意的问题 培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度 PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0 培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10 * 细胞培养中需要注意的问题 容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2～0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的,在深的培养液（5mm）中生长较好。 去除死细胞 温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；温度高于37.5℃，细胞存活力降低 * 细胞系的维持 细胞系档案要记录好； 细胞系的传代、换液一般都有自身的规律性，在维持传代时要注意保持其稳定的规律性； 多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间交叉污染； 每一种细胞系都应有充足的冻存储备。 65 * 培养细胞的纯化 自然纯化 人工纯化 酶消化法 机械刮除法 反复贴壁法 克隆法 培养基限定方法 流式细胞仪分离法 65 * 4.4 培养细胞生长状况的观察 * 培养细胞的常规观察 培养液 细胞生长概况 细胞形态变化 微生物污染 68 * 活细胞的观察 培养细胞相差显微镜观察 培养细胞的动态观察 69 * 细胞生长状况的观察 细胞计数 细胞生长曲线 细胞分裂指数 细胞贴壁率 细胞周期 71 * 细 胞 培 养  Cell Culture  * 第四章 细胞培养的基本技术 4.1 基本操作技术和要求 * 培养前准备 制订试验计划和操作程序 准备各种器材物品 培养室和超净台的消毒 0.2%新洁尔灭托洗地面 紫外灯照射30-60分钟 以75%乙醇擦拭无菌操作台面 培养室内的无菌操作 * 洗手和着装 彻底洗手 以75%乙醇消毒手和前臂 可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。 无菌培养操作 一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 培养室内的无菌操作 * * * * * * 无菌操作中常犯的错误 吸管、剪刀等碰到其他器皿 * 无菌操作中常犯的错误 正确的拿管姿势 错误的拿管姿势 拿吸管时手碰到无菌区！ * 无菌操作中常犯的错误 培养基浸湿吸管底部的棉花 * 4.2 原代培养 * 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中