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专题5·DNA和蛋白质技术 课题3·血红蛋白的提取和分离 【学习目标】了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 【学习重点】凝胶色谱法的原理和方法 【学习难点】样品的预处理 【课堂展开】 一、凝胶色谱法 1、概念：也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。 2、原理 （1）由 构成的凝胶，内部有许多贯穿的 。 （2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。 二、缓冲溶液 1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。 2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。 三、电泳 1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。 2、原理：在一定的 下， 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 。 在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。 3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。 4、方法：常用的电泳方法有 和 。 测定蛋白质分子量时通常使用 。 四、实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 （一）样品处理： 1、红细胞的洗涤： 目的是 。 分离时采取 ，直至上清液中没有 ，表明红细胞已洗涤干净。 2、血红蛋白的释放： 在 和 的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 【思考1】加入蒸馏水和甲苯的目的是什么? 【思考2】洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水? 3、分离血红蛋白溶液： 把 离心后，将试管中的液体用 过滤、除去 ，于 中静置片刻后，分离出下层的 。 （二）粗分离：即透析 1、方法：将血红蛋白溶液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。 2、目的：将 的杂质除去。 3、原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 （三）纯化： 通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下： 1、凝胶色谱柱的制作。 2、凝胶色谱柱的装填。 3、样品的加入和洗脱。 （四）纯度鉴定： 在鉴定的方法中，使用最多的是 。 五、操作提示 1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。 2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的 用 加热，加速膨胀。 3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。 4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。 【探究归纳】 一、人们用鸡的红细胞提取DNA，而用人成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么? 二、凝胶色谱法的原理归纳 【巩固练习】 1．凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。 A.分子的大小 B.相对分子质量的大小 C.带电荷的多少 D.溶解度 2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（ ）基本不变。 A.温度 B.pH