绿僵菌NTL基因上游调控序列的克隆及分析.PDFVIP

2006年4月 重庆大学学报(自然科学版) Apr．2006 第29卷第4期 Journal of Chongqing University(Natural Science Edition) V01．29 No．4 文章编号：1000—582X(2006)04—0073—04 绿僵菌NTL基因上游调控序列的克隆及分析 胡宗利，陈国平，王 中康，彭国雄，殷幼平，蔡绍 皙，夏玉先 (重庆大学生物工程学院，重庆 4ooo3o) 摘 要：实验室已经克隆了金龟子绿僵茵中性海藻糖酶基因(NTL)的编码序列(GenBank登录号： AY557612)，为了解该基因的上游调控信息，采用Panhandle Polymerase Chain Reaction Amplification方法 获得了长为982bp的中性海藻糖酶基因上游序列。序列分析表明，该序列含有5个CAAT启动子元件 和一个压力反应元件(CCCCT)．经PCR和SouthelTl杂交验证表明，利用panhandle PCR法成功地获得了 金龟子绿僵茵CQMal02中性海藻糖酶基因上游序列，并且该基因在金龟子绿僵茵基因组中以单拷贝形 式存在． 关键词：panhandle PCR；金龟子绿僵茵；中性海藻糖酶基因(NTL) 中图分类号：Q78 文献标识码：A 海藻糖酶(EC 3．2．1．28)是海藻糖水解酶，它将 Vector购自Promega公司． 海藻糖水解成两分子葡萄糖．目前，已经从很多生物体 1．1．2 主要试剂 中分离出海藻糖酶…．真菌海藻糖酶根据其最适pH 限制性内切酶、RNA酶、牛小肠碱性磷酸酶 和调节特性分为酸性(或非调节性)和中性(或调节 (CIAP)、T4多核苷酸激酶(T4 PNK)，T4 DNA连接 性)海藻糖酶 J．酵母中的酸性海藻糖酶在pH 4．5 酶、Taq DNA聚合酶为Promega公司产品；High Pure 左右具有最犬活性，定位于液泡-4 ；丝状真菌中的酸 PCR Product Purification Kit和High Pure Plasmid Isola- 性海藻糖酶则定位于细胞壁 J．中性海藻糖酶在pH tion Kit为Roche公司产品；同位素0／．一P弛dCTP购自 7．0显示最大活力，经磷酸化作用而激活，定位于胞 北京福瑞生物工程公司，其余试剂均为进口或国产分 质 J．研究在我们已经克隆昆虫病原真菌金龟子绿僵 析纯试剂． 菌(Metarhizium anisopliae)中性海藻糖酶编码序列 1．1．3 培养基 (GenBank登录号：AY557612)的基础上，为了得到该 1／4SDA (1／4一Strength Sabourauds Dextrose 基因的上游调控序列信息，采用了panhandle PCR方 Agar)培养液：葡萄糖10 g，蛋白胨2．5 g，酵母膏5 g， 法克隆该基因5 端的非编码序列．该方法可以高度特 调pH 6．0，定容到l L，121 oC灭菌20 min．培养基LB 异地扩增与已知位点相邻的大于3．0 kb的人基因组 按《分子克隆实验指南》口 推荐方法配制． DNA 7 J可以应用于染色体步移 J、利用cDNA信息进 ， 1．1．4 引物和寡核苷酸链设计、合成以及PCR产物 行的启动子及基因结构域的定位 、病毒及转座子整 的序列测定 合位点的测定¨。。、不能克隆的DNA的定位和测 根据金龟子绿僵菌中性海藻糖酶5’端已知序列 序 …等． 设计引物1，2，3，4和寡核苷酸链56，验证引物Q539． 4P根据