西北农林科技大学生命学院大三上基因工程.docVIP

西北农林科技大学 基因工程实验报告 GAPDH截短体重组与表达  实验及仪器： 高速冷冻离心机、低温冰箱、液氮罐、研钵、剪刀、镊子、PCR扩增仪、台式离心、恒温水浴锅、微量移液器、培养皿、带帽试管、涂布器、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床、1.4ml EP 管、培养皿、电转印、摇床、紫外灯、恒温水浴箱、电泳仪系统、凝胶成像系统等 实验步骤： 小麦总 RNA 提取（Trizol 法） 材料：小麦幼苗 试剂配制及器具处理 0.1%的 DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） 器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和 1.5ml 和 0.2ml 的 EP 管等用纱布刀、镊子和药匙等 160℃烘烤 6h 以上。 无 RNA 酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶 （180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的 DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 Trizol 试剂 75% DEPC 处理过的水配制 75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 氯仿（最好用新的）。 异丙醇（最好用新的）。 操作步骤 Trizol 法提取总 RNA 先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取 50～100mg 组织粉末加入已盛有 1ml 的 Trizol 液的 EP 管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用 Trizol 体积的 10%），充分混合均匀。 室温放置 5min，然后加入 200μL 的氯仿，盖紧 EP 管并剧烈摇荡 15 秒钟。 12000rpm 离心 10min，取上层水相于一新的 EP 管中 （千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入 500μL 异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置 10min，12000rpm 离心 10min。 小心地弃去上清液，加入 1ml 的 75%乙醇，涡旋混匀，4℃下 12000rpm 离心 5min。 重复步骤④。 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥 5~10min （注意不要干燥过分，否则会降低 RNA 的溶解度）。用 30μL DEPC 处理过的水将 RNA 溶解，必要时可 55℃～60 ℃水浴10 min。RNA 可进行 mRNA 分离，或贮存于 70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上RNA 沉淀在70%，乙醇中可在 4℃保存一周，-20℃保存一年。 RT-PCR 扩增目的基因 cDNA 试剂 RNA 模板 Olig (dT)18 反转录缓冲液 dNTP M-MULV 反转录酶 RNA 抑制剂（RNasin） Premix EX Taq DNA 聚合酶 PCR 特异引物 操作步骤 RNA 的反转录 采用 Thermo Scientific (Fermentas) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 6μL（需加入 RNA 约 1(g） Total RNA 1μL Oligo dT primer 5μL H2O（nuclease-free） 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL Ribolock RNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，-20℃保存 PCR 扩增目的基因 用表达引物扩增目的基因（25μL 体系） 2×PCR Mix 12.5 cDNA 1 引物 GAPDH1-1 1 引物 GAPDH1-2 1 ddH2O 9.5 total 25μL PCR程序： 95℃ 1min 95℃ 10s 58℃ 20s 35cycles 72℃ 45s 72℃ 10min 16℃ PCR产物进行电泳并做胶回收 核酸琼脂糖电泳分析 试剂 TAE 缓冲液（50×）：用时需稀释 50 倍 点样缓冲液 Loading buffer（10×）：含 0.25%溴酚蓝和 40%甘油 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml 溴乙啶，注意 EB 具致癌作用。 琼脂糖 操作步骤 琼脂糖凝胶的制备 称 1g 琼脂糖加入 100ml TAE 缓冲液中加热熔化。 胶板制备 将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入 TA