生物显微技术3-细胞化学和组织化学.pptVIP

第三章 细胞化学和组织化学 细胞化学和组织化学(cytochemistry and histochemistry)技术是以细胞学、组织学为基础，运用物理的和化学的方法来显示细胞组织结构中各种化学物质(如无机物、脂类、蛋白质、维生素、核酸、酶等)的定性、定位、定量的技术，从而分析、研究生物在生理或病理状态下，细胞和组织的代谢、功能及形态的变化规律。 组织化学源自比利时植物学家RaspaiI(1830年)发表《在生理学中使用显微镜观察化学物质》的论著。 初期(1830-1870年)的组织化学主要解释生物界中的生理现象。 (l890-1920年)随着显微镜的改进和组织化学染色技术的发展，组织化学开始脱离生理学而趋向于阐明组织细胞的结构及化学组成，即从生理组织学的概念转为显微化学。 差不多与此同时(1900-1935年)，发现疾病组织中出现的物质变化，更促进了化学技术在病理学染色方法中的应用，也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容，此后又出现了酶的组织化学等。由此可见，“组织化学”一词的含意是随时代而变化的，由定位趋向于与定量相结合的研究。 第一节 细胞化学和组织化学的基本方法 与常规的组织学方法一样，细胞化学和组织化学方法也同样需要经过取材、固定、制片、染色等过程，只是要求更加严格。 一、取材 组织块不宜过大，光镜标本一般为1.5cm×lcm×O.3cm大小，电镜标本的大小约在0·5mm左右。 酶组化之目的使用时，最好在低温的环境下(0~4℃)操作。 二、固 定 固定既要最有效地保存细胞、组织内的化学成分和酶的活性，防止其弥散、移位、溶解、丢失，同时还必须保持细胞、组织良好的形态结构，防止细胞、组织收缩、膨胀、变性、自溶。因此，根据组织内的化学物质、酶的特点，选择适宜的固定剂是非常必要的。 (一)常用的细胞和组织化学固定剂的配制 l、Baker甲醛-钙固定液(固定时间2~4/小时) 商品甲醛10ml，10%氯化钙l0ml，蒸馏水80ml， 此固定液为细胞和组织化学技术中最常使用的固定液，适合各种染色方法。 2、Lillie磷酸缓冲-甲醛液 3、多聚甲醛-磷酸缓冲固定液(多聚甲醛效果优于甲醛) 4、戊二醛磷酸缓冲固定液(固定时间1 ~ 60分钟，适用于电镜) 5、甲醛-蔗糖-磷酸缓冲固定液(适用于多糖类及蛋白质) 以上固定液都必须在冷的环境下(0~ 4℃ )工作。 (二)常用的固定方法 1、浸泡固定法：将固定液置于0一4C冰箱中预冷，检材浸入冷固定液中2一12小时(在冰箱中进行)或者更长。 2、原位冷固定法：将动物麻醉后，在活体情况下，在组织上加冰后，一边快速取材，一边向组织器官滴加预冷的固定液，检材取出后，再用浸泡法固定30分钟-1小时，甚至更长时间。 3、灌注固定法：从心血管途径将固定剂灌注到全身或某一个器官，使细胞保持生活时的状态而不发生移位，固定后再迅速取材。 三、制 片 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。 四、注意事项 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 4、各种试剂的pH值都要调准，否则影响反应结果。 5、所用试剂要纯，都必须达到分析纯(A·R级)。 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或酶的各种特性，做到胸中有数，正确分析实验结果。 第二节 无机物的检测方法 一、显示组织中钙沉着的方法 钙(calcium)广泛存在于体内各器官中。 一般在H-E染色中，钙盐呈蓝黑色或蓝紫色颗粒及片块状沉淀。虽说H-E染色方法可以证明有钙的存在，但特异性不强。 特殊的显示钙的方法较多，如Kossa的金属置换法、Gomori钙块染法、McGeeRuSeell核固红法等。 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 1、操作步骤 (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 (2)核固红染液染色2一10分钟。 核固红染液的配制：核固红2g，蒸馏水100ml洗涤2次，剩下约0.25g核固红残余物，再溶于蒸馏水100ml。 (3)蒸馏水稍洗，常规脱水透明，中性树胶封片。 2、结果：钙盐沉积处红色；其他组织深浅不同的淡粉红色。 3、注意事项 (1)钙盐易被酸性溶液溶解，适宜于用中性甲醛溶液固定，固定时间不宜过长，以免甲醛溶液酸化影响结果。 (2)铁妨碍钙的显示，要避免使用铁质容器。 二、铜质显示法 显示铜的方法较多，如Howell红氨酸改良法。 此法不显示生理量铜。整个操作过程中，避免接触金属器皿，以免产生假阳性。 三、显示铅的玫棕酸法 体内过分含铅的情况下，能用玫棕酸法显示骨和其他组织中铅的含量。玫棕酸法以铅和玫棕酸钠蟹合剂反应为基础，铅盐