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第二章 细胞分离与破碎2 2.2 细胞破碎 2 .2.1 细胞的结构 各种微生物细胞壁的结构与组成 2.2.2 细胞破碎和产物释放原理 细胞破碎理论 1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜 细胞破碎理论 渗透压法：渗透压差(??)为 ?c=细胞内外小分子的浓度差，R=气体常数，T = 绝对温度。 2)、产物释放 如细胞破碎速度与未破碎细胞浓度x成正比，则有 kB为细胞破碎常数 细胞破碎理论 如破碎cell产物释放的速度与cell内外的浓度差成正比，则有 cin为破碎的细胞内产物浓度，cm为产物的最大释放浓度，x0为起始细胞浓度，从上三式得 上式为两步释放的速度方程，如细胞破碎或产物释放的其中一步很快，则表现为一级动力学释放过程，此时方程为 破碎速度控制过程： 释放速度控制方程： 2.2.3 细胞破碎技术 1)、固体剪切法(珠磨法, c最有效的物理破碎法) 操作简介 2.2.3 细胞破碎技术 计算 破碎遵循一级动力学定律, 即 对上述方程积分得 对于n次连续搅拌研磨操作，则得蛋白质的物料平衡式 k 破碎速率常数，?：平均停留时间，V：磨腔的总体积，Q：发酵液的流量。 2.2.3 细胞破碎技术 影响因素 a) 转盘外缘速度(见下图)： 适合条件：圆盘外缘速度 20 m/s, 一般在 5-15 m/s。 b) 珠粒添量和大小 添量：(见上图，添量体积一般占总体积的80-90%) 粒径：一般在0.2mm(实验室), 0.4 mm(工业)。最终由实验确定 2.2.3 细胞破碎技术 c) 温度：温度在5-40?C范围内对破碎影响较小。但研磨产热，功率? ，温度? 。如产物热不稳定，必须控温。 d) 细胞浓度x：最佳x由实验确定。一般产热量随细胞浓度的降低而下降，但单位细胞重量的能耗? 。通常悬液中细菌细胞质量浓度在60-120g/L、酵母细胞质量浓度在140-10g/L时破碎效果较理想 e) 破碎效率： R：每kg成品细胞(如酵母)释放的蛋白量，Q：物料流量，P’：珠磨机消耗的功率。 f) 流量Q：破碎为一级反应。Q?, E?，R?；Q?，E?，R?。 2.2.3 细胞破碎技术 不同流量和搅拌速度下的效率。?-20，?-50，?-100? 10-6 m3/s 流量；1–8， 2–10， 3–15， 4–20 m/s 外缘速度 2.2.3 细胞破碎技术 2)、液体剪切法(最常用的方法之一) 操作 高压匀浆器 2.2.3 细胞破碎技术 计算 服从一级反应定律 式中，R为protein释放量， Rm为pro最大释放量. 影响因素 操作压力p：p?, R? ;相反, R? 。温度? 2?C /10MPa 。 破碎次数N：N?，R ?。 温度：比速度k与温度有关，温度?25?C，k?1.5倍。 细胞抗破碎系数a：a酵母=2.9，a大肠杆菌 = 2.1。 细胞种类：影响k值。 细胞浓度： Z：常数，p0：破碎所需的最低压力，?：细胞浓度的参数。 2.2.3 细胞破碎技术 阀门底座：刃缘阀座，平边阀座 优点 A、在大规模cell破碎中，高压匀浆机和珠磨机用得最多; B、高压匀浆机最适合于酵母和细菌; C、珠磨机可用于酵母和细菌，但对真菌菌丝和藻类更合适. 2.2.3 细胞破碎技术 3) 撞击破碎法 操作：细胞喷雾高速冻结 300 m/s氮气流 优点： A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间，破碎程度均匀，避免反复和过度破碎； B、破碎的程度可无级调节，避免细胞内部结构的破坏，特别适合于细胞器的回收； C、实验室和工业规模均可应用，细胞浓度在10-20%，实验室规模的间歇处理能力在50-500 mL/h，工业规模的连续处理在 10,000 mL/h 以上。 2.2.3 细胞破碎技术 4) 超声破碎法(15—25kHz) 2.2.3 细胞破碎技术 机理 在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation)，空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。 优点：适合于多种细胞的破碎 缺点：A、影响因素多，如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状；B、超声产生超氧离子毒害作用；C、有效能量的利用率低；D、产热大，需控温；E、不易放大，仅应用于实验室规模的细胞破碎。 2.2.3 细胞破碎技术 2.2.3.2 化学破碎法 酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法 酶溶法：利用酶分解细胞壁上的