毒物第五章研讨.pptVIP

第五章 毒物分析常用方法-免疫分析 1959年Berson等建立放射免疫分析(Radio Immunoassay,RIA)，是一种将同位素放射测量与免疫原理相结合的分析方法。用于微量分析，检测限达到pg级(1×10-12g)。 1971年Engvall等在RIA的基础上,建立酶标免疫分析(Enzyme -Labled Immunoassay,EIA)。 用酶标代替放射性同位素标记。无放射危害，操作方便、安全。 1，基本原理 免疫分析的本质是抗原(Antigen,Ag)-抗体(Antibody,Ab)的竞争结合反应。 将纯化的待测物质标准品作为抗原,免疫动物，使其产生特异性抗体，然后根据Ag与其标记物（*Ag：标记抗原）对Ab的特异性竞争结合的程度测定Ag的含量。 由于Ag和*Ag对Ab具有同等的亲和力，因此在免疫反应中，当*Ag，Ab浓度恒定，并且[*Ag]＞[Ab]时，若加入Ag将发生以下反应： 设：F/B=1:1 2*Agt + 2Agt + 2Ab → *Agf + Agf + *AgAb + AgAb 在系列试管中加入规定量*Ag、Ab，再依次加入已知不等量Ag，培育后分离Agf 与AgAb，测定放射活性。以B/F或F/B作纵座标，对Agt作图。据此可测定未知Ag浓度。 RIA标准曲线待测物浓度(Ag,conc.)与所测得的反应计量值(*Ag-Ab)呈反比 2，方 法 2.1，抗原制备 高度纯化的Ag（＞纯度90%）是建立RIA的关键。分子量小的一些小分子缺乏抗原性 (如多数药物、甾体激素等分子量较小的物质)称半抗原（Hapten），接到 carrier 後也可诱生抗体。如通过戊二醛等与蛋白质或多肽等大分子（如牛血清白蛋白等）共价结合,提高动物免疫性，使其产生特异抗体(Ab)。例如吗啡分子结构有多个位点可连接蛋白质。 2.2，标记 ⑴、放射性同位素标记 通常半抗原先与酪氨酸偶合，然后标记。目前最常用的放射性同位素是碘-125（半衰期60天，含量：95﹪，能量低：约40 KeV）。或3H标记Ag。能谱仪检测（3H标记，用液闪测定）。 ⑵、酶标免疫分析 用特异性酶作标记，例如吗啡用苹果酸脱氢酶(malate dehy -drogenase,MD)标记，形成吗啡-MD。测定时被测吗啡与吗啡-MD竞争性结合吗啡抗体。由于吗啡-MD结合愈多其活性愈小，测定底物浓度即可计算分析物含量。 2.3、抗体产生 抗体的产生是RIA的关键，通常用50-100mg抗原加佐剂混合后给家兔、豚鼠或羊等动物全身多点皮下注射（或脚底、皮内、肌肉等）。注射适当次数后取血做滴度测定。由于纯化抗体困难，因此用抗血清(Antisera)代替。 2.4、标准曲线制备 放射免疫分析 A，根据待测样品的最低浓度及滴度曲线，选定Ab稀释度，在一系列试管中加入等量的*Ag及抗血清。然后加入不同浓度的标准Ag进行培育（在pH7.4磷酸盐-三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，37℃进行）； B，通过活性炭、硅藻土或凝胶柱使*Agf 及*AgAb分离。 C，清液测定放射活性，以B/F或F/B对Ag浓度作图。 3、应 用 3.1、放射免疫分析 尿中D9-THC(四氢大麻酚)的测定：检测限15mg/L，误差±4%。吸食后尿中排出高峰在2-6hr，持续排出24hr。 3.2、酶免疫分析 ⑴、血、尿中苯丙胺的测定：溶菌酶标记，检测样品仅需0.05ml，检测限40ng，误差±0.02mg/L。 ⑵、血、尿中吗啡的测定：溶菌酶标记，检测限0.5mg/ml 1.空白试验:空白试验是在实行一个检测方法时,除了不加入已知欲检测物以外,其他所用检验材料,溶剂,试剂,器皿,设备,操作步骤等等都完全与所作检验中的相同;也称为空白对照试验. 2. 毒性作用:生物体受到一定量的毒物作用而引起功能性和器质性改变后出现的疾病状态称为中毒,由毒物所产生的中毒反应称为毒性作用. 3. 药物滥用:是指非医疗目的,不正常的连续大量使用能够产生依赖性(精神依赖性和生理依赖性)的药物  新疆医科大学药学院药分/分析教研室 * 溶菌酶 鸡蛋清 14000 细胞壁 比色法 葡萄糖淀粉酶 酵母 淀粉