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第六章 DNA重组及重组DNA技术 Chapter 6 DNA Recombination and genetic engineering 同源重组(homologous recombination) 位点特异性重组(site-specific recombination) 转座重组(transposition recombination) 不正常重组(iilegitimate recombination) 人工重组（artificial recombination） 四种DNA遗传重组的特征 第一节 同源重组(homologous recombination) 一、概述 概念：发生在同源DNA序列之间的重组称为同源重组。 二倍体真核生物: 交换（ crossing over） 真核生物中，精卵细胞发育过程中进行减数分裂时非姊妹染色单体之间发生的DNA交换。 联会（Synapsis）: chromosome pairing. 减数分裂时同源染色体配对 非姊妹染色单体中DNA片断的等价交换 同源重组是同源依赖的，而不是序列依赖的 。 基本特征：这种重组方式要求两段DNA序列相似或相同，并在特定的重组蛋白或酶的作用下完成。 基本功能：遗传混合和DNA修复。 作用：真核基因组的遗传作图和基因克隆。 二、同源重组的机制 DNA受紫外光、X-射线、化学药剂的处理，双链就断裂或产生缺口或产生单链区，增加DNA交换的机率。 在复制、修复过程中，因细菌DNA连接酶和DNA聚合酶I的基因发生突变而失活。 限制性内切酶切割供体DNA，有利于受体DNA的重组。 减数分裂过程中，联会染色体的偶然断裂诱发重组酶的活性，原核生物的基因接合或交换等。 （二）同源重组机制 2. 异源双链 异源双链(heteroduplex DNA)：含有由两个亲本DNA单链区域组成的双螺旋。 3. 支链迁移 P166-167branch migration 4. DNA分子配对P168-170 三、同源重组的步骤 两条同源DNA链的断裂和同源DNA链的配对（联会） 链转移（包括起始、链的交换和分支迁移） 修复 解离 几个概念 连接体：两个配对DNA双螺旋同源片断的相应位点发生断裂，由此产生的自由末端可以移动，每个单链与相对应的另一个双螺旋上的互补链交叉配对。 连接分子(joint molecule)：一对相连的双链DNA。 重组体连接点(recombinant joint)：一个DNA分子上的一股单链与另一个双螺旋的交叉位点。 异源双链(heteroduplex DNA)：含有由两个亲本DNA单链区域组成的双螺旋。 解离（resolution）：参与重组的DNA分子的分离切割过程。 四、同源重组模型 P178-182 Holliday模型 不对称链转移模型 1. Holliday模型 Holliday结构 重组中，连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在其连接点为了转换配对所形成的交叉链的接头，称为Holliday结构。 在连接点上主链能自由旋转，使链交换时不失去碱基对，能等价消除拓扑束缚力。 2. The Meselson-Radding Model不对称链转移模型 3、 8字形分子的解离 五、参与同源重组的蛋白质P183-191 和切口处的单链DNA结合，阻止其与互补序列配对和联会。 启动单链转移并帮助侵入链在受体DNA螺旋中扫描同源区域 促进链的交换。 2、RecBCD酶及其作用 RecBCD酶：具有解旋酶活性、外切核酸酶活性、ATP酶活性 只作用于双链DNA的平末端（体外实验系统） 在χ序列（CHI位点）产生单链3’末端，引起重组起始。 RecD解离， RecBC继续前进。 The RecBCD pathway of homologous recombination 3、参与同源重组的其它蛋白质 RuvA：活性状态是四聚体，与Holliday交叉点结合，使4条DNA单链片断处于分离态。DNA解旋酶活性 RuvB： 分子泵和ATP酶活性 RuvC：切开Holliday 结构产生DNA重组 真核及其它同源重组酶 人和酵母：RAD51—催化同源DNA片断配对、介导单链侵入及寻找同源序列。 Cre蛋白：催化位点专一性重组 同源重组的意义 产生遗传多样性 重组修复DNA损伤 第二节 位点专一性重组 P173-176Site-Specific Recombination 1. 两个非同源双链DNA分子间发生在特定位点的同源交换 2. 由某些蛋白质识别这些特定位点的DNA序列介导完成重组 一、噬菌体的整合 外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。 整合后的外来DNA仍