怎样利用转基因试剂盒快速检测Bt转基因水稻.docxVIP

如何利用转基因试剂盒快速检测Bt转基因水稻 一、转基因试剂盒基本简介： 目前获得转基因生物安全证书的两种转基因水稻（“华恢1号”和“Bt汕优63”）都能够产生两种蛋白质Cry1Ac和Cry1Ab，在快速检测过程中，样本中只要有两种中的任何一种蛋白质，试纸条就会显示阳性。 托普云农转基因试剂盒能检测Cry1Ac和Cry1Ab两种蛋白质，即使样本是其他的转基因品种，但是不能产生这两种蛋白质的话，快速检测试纸条也没有作用。所以，此试纸条不能检测转基因大豆，需要用专门的检测试纸条。 托普云农转基因试剂盒系用特异性抗 Cry1Ab/1Ac 单抗包被的微孔板和酶标记抗 Cry1Ab/1Ac 单抗，双抗体夹心法检测 Cry1Ab/1Ac 基因表达产物，可以高灵敏度和特异性的检测转基因植物中的 Bt-Cry1Ab/1Ac 蛋白。 二、转基因试剂盒准备样品： 将可疑的大米、稻种（去壳，约10-20粒）磨碎，尽量达到粉末状。如果是水稻叶片（约3-4片），需捣碎至泥浆状。 三、转基因试剂盒配制蛋白质提取液： 将检测用的粉末和纯净水以1：10的比例（体积比）混合，充分摇匀备用（约3分钟）。 容器可以选择10ml的塑料密封管。 配制完成后常温保存，当日配当日用。 转基因试剂盒提取蛋白质： 将磨碎的样本和提取液以1：4的比例（体积比）混合，充分摇匀（约1-2分钟），混合均匀后静置备用。 容器可以选择1.5ml的塑料密封管。 五、转基因试剂盒快速检测： 保持垂直方向将检测试纸条上标有“sample”的一端浸入样品提取液中。试纸条浸入样品提取液的部分不要超过0.5cm。在整个检测过 程中要保持试纸条始终浸在样品提取液中（3-5分钟即可）。 六、转基因试剂盒结果分析： 质控线一般会在3—5分钟内出现。最长的反应时间为20分钟，在这段时间里最好将试纸条从样品提取液中取出。如果质控线没有出现，那么本次检测失败。 测试线显现，说明样品为阳性。 测试线不显现，说明样品为阴性。 测试线的颜色变化与质控线的颜色变化一样，都是由红变紫。 检测试纸条需保存于4度低温条件，如在野外条件艰苦，尽量避免 暴露在高温下。 七、转基因试剂盒试剂盒组份： 预包被板（抗 Cry1Ab/1Ac 单抗） 12 孔×8 Cry1Ab/1Ac 酶标抗体 12 ml×1 瓶 20×浓缩洗涤液 30 ml×1 瓶 5×抽提液/稀释缓冲液 30 ml×1 瓶 底物液 A 7 ml×1 瓶 底物液 B 7 ml×1 瓶 终止液 7 ml×1 瓶 使用说明书 1 份 0ppb 阴性对照 1ml 4 个不同浓度的标样： 0.5 ppb 1.0 ppb 2.0 ppb 4.0 ppb 各 1ml 八、转基因试剂盒准备工作： 试剂盒中的 20×浓缩洗涤液 30 ml 加 570 ml 灭菌 ddH2O 溶解稀释至 1×洗涤液，5×抽提液（30 ml）加 120 ml ddH2O 稀释至 1×抽提液，4℃存放备用。 九、转基因试剂盒样品准备： 称取约 20 mg 叶片，加 0.5 ml 1×抽提液（使用前 30 min 放置室温）研磨至匀浆，室温放置 30 min，测定前把样品上清液稀释 5-20 倍。 测定茎干和胚乳中的 Bt 蛋白时，样品称取约 40 mg，加 1ml 1×抽提液研磨。 十、转基因试剂盒ELISA 反应： 1. 依次加 100 μl 阴性对照，标准品（4 个不同浓度的标样：0.5 ppb，1.0 ppb，2.0 ppb, 4.0 ppb）和待测样品至 96 孔板； 2. 用封口膜盖住 96 孔板，快速摇动平板混匀样品； 3. 37℃恒温箱孵育 30 min； 4. 倒掉 96 孔板中液体，每孔加入 1×洗涤液 250 μl 洗涤微孔 板，洗板 5 次，用吸水纸拍干； 5. 按顺序在每个小孔中加入 100 μl Cry1Ab/1Ac 酶标抗体，然 后重复步骤 2； 6. 37 ℃恒温箱孵育 30 min； 7. 倒掉 96 孔板中液体，每孔加入 1×洗涤液 250 μl 洗涤微孔板，洗板 5 次，用吸水纸拍干； 8. 依次加入 50 μl 底物 A 液，50 μl 底物 B 液，重复步骤 2； 9. 室温（20-25℃）避光孵育 10 min，加 50 μl 终止液，充分混