家蝇防御素的克隆及在毕赤酵母中的表达.pdfVIP

第 45卷 　第 3 期 中山大学学报 (自然科学版 ) Vo l45　No3 　 2006年 　5月 ACTA 　SC IEN T IARUM 　NA TURAL IUM 　UN IV ER SITA TIS　SUN YA TSEN I M ay　2006 　 家蝇防御素 defen sin cDNA 的克隆及 在毕赤酵母中的表达 金丰良, 许小霞 , 赵士炜 , 古德祥 , 张文庆 (中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室 , 广东 广州 5 10275) 摘 　要 : 提取家蝇总 RNA , R T - PCR 扩增编码家蝇防御素 defen sin 的 cDNA , 克隆并测定了其序列 , 将该 cDNA α α ( 序列与酵母表达载体 p P ICZ A 重组 , 构建酵母分泌型表达载体 p P ICZ - de, 电激法转化毕赤酵母 P ich ia p as to ris) 受体菌 GS115。经表型筛选和 PCR 鉴定证明目的片段已稳定整合到酵母染色体基因组中。在含不同浓度的 Zeocin平板上筛选到高拷贝整合的转化子 , 阳性克隆经甲醇诱导表达 , 用 Tricine - SD S - PA GE确定了表达产物 的正确性 , 琼脂孔穴平板扩散法 、比浊法测定了表达产物的活性 , 对金黄色葡萄球菌 S tap hy lococcus au reus 具有 一定的杀菌活性 。 关键词 : 家蝇 ; 防御素 ; 毕赤酵母 ; 诱导表达 , 活性测定 Q78　　 A 　　 0529 - 6579 (2006) 中图分类号 : 文献标识码 : 文章编号 : 　　抗菌肽最早在昆虫体内发现 , 是一类免疫效应 度 27 ～28 ℃。大肠杆菌 TOP10F ’、TG1、金黄色 因子 , 它在机体的先天非特异性免疫中起重要作 葡萄球菌 S tap hy lococcus au reus、酵母菌株 GS115及 [ 1 ] α 用 , 构成了低等动物机体快速有效的免疫机制 。 酵母表达载体 p P ICZ A 由本实验室提供 ; RNA 抽 昆虫被病菌感染或受到伤害后 , 能快速合成大量抗 提 Trizo l试剂盒及反转录试剂盒购 自 Invitrogen 公 菌肽 , 迅速杀灭入侵病菌 , 可阻止病菌的继续侵 司 , 各种限制性内切酶和 T DNA 连接酶购 自 Pro 4 染 。迄今从各种生物体中获得的抗菌肽分子有 500 m ega公司 , pMD 18T载体和各种抗生素购自 TaKa 多种 [ 2 ] 。 R a公司 , 其余试剂均为国产分析纯 。 抗菌肽相对分子质量小 , 抗菌谱广且效率高 , 12　方法 作用机制独特 , 不易产生抗性 [ 3 - 4 ] 。在抗生素的抗 12 1　家蝇幼虫免疫诱导 　家蝇幼虫经生理盐水 药性日趋严重的情况下 , 抗菌肽极有可能成为新的 洗涤