Western blot 实验步骤要点.doc

Western blot实验： 4.应用仪器: （1）聚丙烯酰胺垂直电泳及转膜系统 美国 Bio Rad 公司 （2） HPIAS-1000型图像分析系统 日本 Olympus 公司 （3） IX70型荧光倒置显微镜 日本 Olympus 公司 （4） 高速冷冻离心机 德国 Eppendorf 公司 （5） 超低温冰箱 日本 Sanyo 公司 （6） CO2培养箱 美国Shill公司 （7） 超净台 苏州净化设备公司 （8） 微量移液器 德国Eppendorf 公司 （9） 电子分析天平 美国sartorius公司 5.试剂:（中英文,购买厂商 Cyclin D一抗 P38 一抗 β-actin 一抗 MMP-9一抗 美国Santa Cruz 公司 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔（HRP Goat anti-rabbit IgG），山羊抗小鼠二抗(HRP Goat anti-mouse IgG) 武汉博士德公司 BCA蛋白定量试剂盒 康为世纪 公司 Western blot 荧光检测试剂盒(Chemiluminescent Substrate) Santa Cruz 公司 聚丙烯酰胺(Acrylamide)，亚甲聚丙烯酰胺(N,N’-Methylene Bisacrylamide)，TEMED，过硫酸胺(Ammonium Persulfate)，PVDF膜 公司 6.液体配置和保存: （1）、液体的配制： ①、30%聚丙烯酰胺（隔数月重配）：有毒，应注意带口罩和手套。所用称量纸应丢弃。 29g丙烯酰胺 加80mlDW于棕色瓶，溶解后补水至 1g NN-亚甲基双丙烯酰胺Tris base 18.15g 溶解后，用HCL调PH值至8.8。补水至100ml， DW 80ml 4℃保存。 ③、1Mol Tris.cl(PH6.8) Tris base 6.05g 溶解后，用HCL调PH值至6.8.补水至50ml. DW 35ml 4℃保存。 ④、10%SDS 称取电泳级SDS10g于90mlDW中溶解，加水至100ml.于室温保存。如果气温低，可变成白色，需加温使其液体清亮后方可使用。 （5）、10%过硫酸胺（限一周内使用）4℃保存。 称取0.1g过硫酸胺溶解于1mlDW即可。 ⑥、TEMED(购买)。 4℃避光保存。 ⑦、电泳buffer: (PH8.3,一般不需调PH值)。常温保存。 可配5×储存液：在900mlDW中溶解15.1gTris Base和94g甘氨酸，再加入50ml10%的SDS液，加水补至1000ml即可。 ⑧、转移buffer(配1000ml): 39mmol/L 甘氨酸 称取甘氨酸29g，Tris Base 5.8g,SDS0.37g 48mmol/L Tris Base 加到700mlDW中，再加甲醇200 ml,最后补水 0.037%SDS 至1000ml即可。 20% 甲醇 ⑨、5×上样buffer: 250mmol/L Tris.cl(PH6.8) 500 mmol/L DTT 10%SDS 0.5%溴芬蓝 5%甘油 ⑩、TBST (PH为7.6)1000ml ： Tris Base 2.42g Nacl 8g 溶于950mlDW中，调PH，最后补水至1000ml. Tween 1ml 7、Western实验步骤Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。1）. 蛋白提取 细胞以预冷的PBS洗涤3-4次之后，用滤纸吸干残余的PBS液体 在50ml培养瓶中加50ulRIPA(裂解液)，以及100mol/L的PMSF0.5ul(100:1)(蛋白酶抑制剂) 作用30分