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蛋白酶用途: 来自 《酶工程 附实验 第2 版》 -禹邦超，胡耀星主编 2007 张树政主编.酶制剂工业 下册.科学出版社,1984年07月第1版. 蛋白酶的活力测定原理及方法 231．凤曲蛋白酶活力测定原理和方法是什么?原理微生物的生长代谢和酶的生成都需要蛋 白质作氮源。酒中许多香味物质的形成与蛋自质的分锵有关。风曲中的蛋白酶是指水解蛋白 质肽键的酶类总称。它能将蛋白质水解成氨基酸。通常以适宜于酶活力的pH将蛋白酶分为 酸性蛋白酶(pH2．5—3．0)、中性蛋白酶(pH7左右)和碱性蛋白酶(pm 以上)。其酶活力 测定方法基本相同，只是控制不同的pH进行测定而已。在测定蛋白酶活力时，以酪蛋白(干 酪素)为底物，蛋白酶将酪蛋白水解生成含酚基的酪氨酸，在碱性条件下使福林试剂还原产 生蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物)，然后用分光光度计在680nm下测定吸^光度。蛋白酶活力 定义是1．09大曲(绝干曲)在400C和一定的pH条件下，lmin将酪蛋白水解产生lpg氨 基酸为1个酶活力单位，以(u／g)表示。 试剂和溶液：(1)福林试剂称取sog钨酸钠(Na2WO+·2I-120)。12．59钼酸钠(Na2M004· 2琏O)于1000mL烧瓶中，加入350mL水、25mL85％磷酸、50mL浓盐酸，微沸，回 流10h。取下回流冷凝器后，加入259硫酸锂(kso+)、25mL水，混匀，加入数滴溴(99． 9％)脱色，直至溶液呈金黄色。再微沸 15rain，驱除残余的溴(在通风橱中操作)。冷却后 用4号耐酸玻璃滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。使用时再用水稀释，滤液与水比为1： 2。(2)0．4mol／L碳酸钠溶液称取42．49碳酸钠，溶于水并稀释至 1L。(3)0．4mol ／L三氯醋酸溶液称取65．59三氯醋酸溶于水，并稀释至1L。(4)10e ／k酪蛋白溶液称 取lg酪蛋白(即干酪素，准确到O．0019)，于100mL容量瓶中，加入约40mL水及2— 3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后用pH7．5磷酸缓冲液(用于测定中性蛋白酶) 稀释定容至100mL，贮存于冰箱中备用，有效期为3d。(5)pH7．5磷酸缓冲液①O．2mol ／L磷酸二氢钠溶液：称取31．2g磷酸二氢钠(Nl屿地·2I120)，溶于水并稀释至lL。② 2mol／L磷酸氢二钠溶液：称取 71．6g磷酸氢二钠(N也l-IP04·12玛O)，溶于水并稀 释至 1Lo③取28mL(1)液和 72mL(2)液，用水稀释至lL 即为pH7．5磷酸缓冲液。(6) 标准L-酪氨酸溶液(1∞彬l也)准确称取105℃干燥过的L一酪氨酸0．1冀于100mL容量 瓶中，加6(hnLlmol／L盐酸溶液，在水浴中加热溶解，用水定容至刻度，其浓度为lme／ mL。再用0．1mol／L盐酸稀释 10倍，即为100pg／mL标准溶液。(7)pH3．0的乳酸 一乳酸钠缓冲液①称取80％一90％的乳酸10．6g，用水定容至lLo②称取 70％的乳酸钠 169，用水溶解定容至lL。③吸取上述①液8mL和②液lmL，混匀并稀释l倍，即为0．05mol ／L乳酸一乳酸钠缓冲溶液。(8)pmO．5焉砂一氢氧化钠缓冲液030．1mol／L氢氧化钠 溶液。②O．2mot／L硼砂溶液。称取19．∞g硼砂，溶于水，并稀释至lL。③吸取40㈣ 液和．S00mI 囝液混合，用水定容至lL，即为DHl0．5 的硼砂一氨氧化钠缓冲液。注：缓 冲液配制好后，均需要用pH计实测，校正。 测定方法： (1)绘制标准曲线准备9支20mL带盖试管，用l 嘶喀,／mL 的标准酪氨酸溶液配制标准系 列 如 表 13-1 。 表 13-1 标 准 溶 液 的 配 恻 吸取稀释后的标准液各1．00mL，分别放人9支10mL试管中，加入5．00mid．4rml／ LNa2C03和1．00mL福林试剂。在(们±0．2)℃水浴中加热20rain显色，在690nm 波长浏光密度，以不含酪氨酸的“O”试管为空白，绘制浓度对光密度通过零点的校正曲线。 在曲线上查得光密度为l 时对应酪氨酸的腭数，即为吸光常数K值。该K值应在95—100 范围内，可作为常数用于试样计算。但若新配显色剂或更换仪器，则需重测K值。(2)5％ 酶浸出液(中性酶)称取相当于109干曲的试样，要求精确至0．019，10X[100／(100一 大曲水分％g)]，加pH7．2磷酸缓冲液(_使俸积为蛳)，在水浴中漫出30rain，根据酶活 力高低，必要时可再用缓冲液稀释一定倍数，以使光密度的测定值在0．2—0．4范围内， 然后用干的定性滤纸