高效液相色谱仪要点.pptVIP

高 效 液 相 色 谱 2010/8/21 一、高效液相色谱仪 二、高效液相色谱法的特点 20世纪70年代后发展迅速，它在技术上采用高压泵，高效固定相和高灵敏度的检测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。 特点：高压、高效、高速 分离对象：适用高沸点、热不稳定有机及生化试样分离分析 （与GC区分） 三、流程及主要部件 流程 样品环(Loop) 规格：有10μL、20μL、50μL等不同容积， 可以根据需要选配。 作用：用来贮液，也用来测量样品溶液的体积。 将样品环装满后进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。 用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。 工作原理：基于朗伯-比尔定律。 即用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。 它具有波长固定，波长可变和光电二极管阵列三种类型。 工作原理:通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气(氮气)喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 适用范围：适用检测挥发性低于流动相的组分，主要用于检测糖类，高级脂肪酸，磷脂， 维生素，氨基酸，甘油三酯及甾体等。 特点：通用型检测器，对各物质有几乎相同的响应。 消除溶剂的干扰，不受温度变化影响， 　　　 灵敏度比较低（尤其对有紫外吸收的组分） 流动相必须是挥发性的，不能含有缓冲盐等。 四、液相色谱的流动相 流动相特性 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变各组分分离状况。 亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 2. 流动相类别 按流动相组成成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 正己烷、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醇、 甲 醇、异丙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。 4. 选择流动相时应注意的几个问题 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法 正常进行。 在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相 中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量 氧与样品发生作用。 尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确 输液均匀准确，并且脉动减小 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能 防止气泡引起的尖峰 基线稳定，信噪比增加 溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱 减少死体积 防止填料的氧化 常用的脱气方法 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度 比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min。 在线真空脱气法（实时在线脱气，效果好） 五、HPLC应用 1. 分析方法如何建立？ 色谱柱和检测器的选择 根据被分离物质性质选择；参考文献类似物质 疏水性的样品——反相键合色谱； 亲水性的样品——正相键合色谱； 流动相组成,配比,流量,梯度洗脱的选择 根据分析样品的结构、性质，并查阅相关文献确定流动相组成。 为达到较好的分离效果，确定流动相配比。 当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时，考虑梯度洗脱。 当分析弱酸，弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及加醋酸、三乙 胺等调节流动相 的pH值来改善峰型。 样品组分保留值和容量因子的选择 分析时间最好控制在10～30min 容量因子控制在1～10；对于容量因子范围较宽的