细胞裂解实验方法总结.docx

细胞裂解是改变细胞通透性和活性的重要实验方法。主要分为化学法和机械法，前者比较温和，后者虽然产量高，但反应更剧烈，很有可能造成细胞中的DNA断裂。本文主要是介绍细胞的裂解方法以及实验过程中的方法探讨。裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。一、机械裂解法主要有以下两种：1. ?热休克(Thermal shock)，既反复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing)，。原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20??℃?冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100 ℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。2. ?超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法，把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。bead-beating 也是常用的机械处理方式，有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好虽然DNA产量较高，但通常得到的DNA片段较小。二、化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)主要是裂解液处理法，细胞裂解液的主要目的有以下几种：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。主要根据不同的目的，裂解液的组成有所不同，主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时，我们主要是要充分裂解细胞，得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白，那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液，在提取蛋白后，再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用：50 mMTris-HCl pH 7.4(缓冲体系)，150 mMNaCl(等渗体系)，1 mM PMSF (强大的蛋白酶抑制剂)，1 mM EDTA(变性剂和稳定剂)，5 μg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂)，5 μg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂)，1% Triton x-100(破坏细胞)，1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂)，0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解)，蛋白酶K等。细胞裂解时间把握问题：孔板里细胞用PBS洗2次后，加入细胞裂解液，然后去测总蛋白含量和酶的活力，不知道细胞要裂解到什么程度?答：因为所用的细胞类型不一样，所以实验的条件也需要摸索，建议这样来做：加入细胞裂解液后，不同时间取样，以时间和总蛋白含量和酶的活力作曲线，这样就可以找到裂解的最佳时间，仅供参考。原核表达的细胞裂解问题：做原核表达，用BL21表达，之后如何裂解细胞才行呢?我的菌液只有300微升，说明书上用超声裂解细胞，但没给出具体做法，我们这只有大的探头，不好做，有什么好的办法么??要是用超声裂解，要怎么做才行?我是超声15 s间隔10 s座4次。裂解不好，应该怎样改呀?!答：请试一试IFCC推荐法：1. ?收集细胞悬液2. ?4??℃??低温离心(3000 rpm，5min)3. ?弃上清，加入一定量PBS(200 ul)，轻轻吹打混匀，-20??℃??冷冻30 min，?37??℃??解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液三、western blot细胞裂解方法个人小结：过些天准备做western blot，昨天就提前把细胞裂解了，提出蛋白来保存。一下是我做的方法，大家参考，可能有不正确的地方，希望大家指出来，谢谢!1. ?取一瓶细胞(100 ml的瓶子)，PBS洗2次，胰酶消化，加入10 ml 培养液，制备成细胞悬液；2. ?将细胞悬液移入10 ml离心管中，4??℃?，2500 rpm，离心5 min；3. ?弃上清，加入预冷的PBS(即4??℃?存放的PBS)于离心管中，吹打，4??℃?，2500 rpm，离心5min；弃上清，重复上述步骤一次；共洗细胞2次，充分洗掉培养液；4. ?弃上清，加入200 ul细胞裂解液(每1 ml裂解液中加入10 ulPMSF)，置于冰上，裂解40 min～1 h；裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，以使蛋白充分裂解；5. ?取出离心管，于4??℃?，12000 rpm，离