细菌内毒素检查操作程序.doc

细菌内毒素检查操作程序 1 概述：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/mL的灭菌注射用水。 2 凝胶法 系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理检测的方法。 2.1 材料准备 2.1.1 0.1ml/支规格及灵敏度的鲎试剂，细菌内毒素检查用水以及细菌内毒素国家标准品或工作标准品。 2.1.2 恒温器、旋涡混合器、试管架、计时器、剪刀、封口胶布、砂轮片、酒精棉球、酒精灯、灭菌的1ml玻璃注射器、烘箱。 2.2 实验操作 2.2.1 接通恒温器电源，将温度调节至37℃±1℃。 2.2.2供试品稀释 2.2.2.1 当供试品需要控制的内毒素限值大于鲎试剂灵敏度时，需要对供试品进行稀释，计算公式如下： MVD＝L/λ MVD：供试品的最大有效稀释倍数 L：供试品需控制的内毒素限值（EU/mL） λ：鲎试剂灵敏度值（EU/mL） 2.2.2.2[举例]某供试品需要控制的内毒素限值为5EU/ml，使用灵敏度λ＝0.25EU/mL的鲎试剂作细菌内毒素检查.MVD＝5EU/ml / 0.25EU/mL＝20倍。即供试品需作1:20稀释后再作检查。若检查结果为阳性，表明供试品内毒素含量≥5EU/ml，超过限值；若检查结果为阴性，表现供试品内毒素含量＜5EU/ml，低于限值。 2.3 检查操作 2.3.1供试品溶液制备：取0.2g糖粉，加入2ml检查用水稀释，混匀，备用。 2.3.2 取0.1ml/支规格的鲎试剂8支，折断（或割断）安瓿颈，其中2支作为供试品管，2支作为阴性对照管，2支作为阳性对照管。2支供试品阳性管。 2.3.3 阴性对照管加入0.2ml水，其余各管加入0.1ml水复溶；供试品管各加入0.1ml供试品溶液，阳性对照管加入0.1ml2.0λ浓度的内毒素溶液，供试品阳性对照管加入0.1ml供试品阳性对照溶液[用被测供试品溶液将同一支细菌内毒素工作标准品制成2.0λ浓度的同毒素溶液。 2.3.4封闭管口，轻轻摇匀，放入37℃±1℃恒温器中保温60±2分钟，保温和拿取 试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 2.4 结果判断 2.4.1 将试管从恒温器中小心取出，缓缓倒转180℃时，若管内凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（+）；不呈凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（一）。 2.4.2 阴性对照管必须呈阴性，阳性对照管、供试品阳性对照管必须呈阳性，实验有效，否则无效。 2.4.3 供试品管2支均为（一），应认为符合规定；如2支均为（+），就认为不符合规定；如2支中1支为（+），1支为（一），按上述方法另取4支供试品管复试。复试时，需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合 规定。 2.4.4若阴性对照管为阳性，表明鲎试剂或水或检验器皿受到污染，若阳性对照管为阴性，表明鲎试剂或内毒素已失效，或鲎试剂的灵敏度及内毒素的效价标示不准确，或内毒素的稀释有误；供试品阳性对照管为阴性，表明供试品反应体系有抑制反应进行的干拢因素存在。 鲎试剂灵敏度复核试验 3.1本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 3.2 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒草素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、0.5λ各0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1mL不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。 3.3 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 3.4 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即