4蛋白质的分离纯化和表征2015.pptVIP

蛋白质的分离纯化和表征 ◆ 一、蛋白质的酸碱性质 ◆ 二、蛋白质分子的大小和空间结构 ◆ 三、蛋白质的胶体 性质与蛋白质的沉淀 ◆ 四、蛋白质分离纯化的一般原则 ◆ 五、蛋白质的分离纯化方法 ◆ 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小和空间结构 蛋白质分子量很大，相对分子量变化范围在6000-1000000或更大一些。 测定蛋白质分子量的方法： 1.根据蛋白质化学组成测定最低相对分子量 2.渗透压法测定相对分子量 3.蛋白质的扩散和扩散系数 4.沉降分析法测定蛋白质相对分子量 5.凝胶过滤法测定相对分子量 6.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 ◇（1）蛋白质的胶体性质 ◇ （2）蛋白质的沉淀 （1）蛋白质的胶体性质 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。 蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子表面的亲水基团，如一NH2，-COOH,-OH以及 –CO-NH-等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层，每克蛋白质分子能结合0.3～0.5克水。 蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pH条下．都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。 蛋白质溶液由于具有水化层—— 双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相当稳定的，如无外界因素的影响，就不致互相凝集而沉淀。 蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜。 （2）蛋白质的沉淀 蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性既然与质点大小、电荷和水化作用有关，那么很自然，任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质溶液的稳定性。 盐析法 盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸胺、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后，复可溶解。 有机溶剂沉淀法 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处理的时间则可使变性速度减慢。 重金属盐沉淀法 当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再服用催吐剂排出体外。重金属盐常能使蛋白质变性，这可能是因为重金属盐水解生成酸或碱的缘故。 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如骤酸也称单宁酸苦味酸即2，4，6-三硝基酚，钨酸和碘化钾等。 某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。 加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2 )的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。 四、蛋白质分离纯化的一般原则 ◇ 1.前处理 ◇ 2.粗分级分离 ◇ 3.细分级分离 1.前处理 植物组织和细胞，由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。 细菌整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。 如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。 2.粗分级分离 当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大