酵母菌的形态观察和死活鉴别与显微直接计数法.docVIP

酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微镜直接计数法 I 酵母菌的形态观察及死活鉴别 一、目的要求 观察酵母菌的细胞形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。 二、基本原理 酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。用它采对酵母细胞进行染色。活细胞内由于新陈代谢作用而具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母活细胞染色后无色。而死细胞或代谢缓慢的老细胞因无还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。 三、器材 酿酒酵母（Saccharomyces cerevissiae）； 0.1％吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液； 显微镜，载玻片，盖玻片等。 四、操作步骤（美蓝浸片观察） (1)在载玻片中央加一滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养48小时的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。 (2)用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将盖玻片平放下去，应先将盖玻片的一边与液滴接触；然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。 (3)将制好的水浸片放置3分钟后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。 五、实验报告 (1) 绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。 II 显微镜直接计数法 一、目的要求 1．明确显微镜计数的原理。 2．学习使用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、基本原理 利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜F进行计数。由于计数室的容积是一定的(0.1mm3)，所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。 血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。 计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格.；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格.。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16 X 25：400小方格。 每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。 在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。 下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数(即0.1mm3中的总菌数) 为A/5X 25XB。 因 1ml=1Gm3=1 000mm3，故1ml菌液中的总菌数=A/5 X 25 X 10 X 1000 X B=50,000 A X B (个)。 同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数1ml菌液中总菌数A＇，则1ml菌液中的总菌数= A＇/5 X 16 X 10 X 1000 X B＇= 32,000 A＇X B＇(个) 三、器材 酿酒酵母菌悬液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。 四、操作步骤 1．将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。 2．镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。 3．加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴(不宜过多)，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。 4．显微镜计数 静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个