1 .2 基因工程的基本操作程序.ppt

基因包括编码区和非编码区 ----转录时的关键RNA聚合酶的作用 ----转录时,非编码区和RNA聚合酶结合,催 化编码区转录 从基因文库中获取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别 含有这种生物的不同基因，称为基因文库 提问：你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？ 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA →DNA杂交分子。 第二步，核酸酶H使RNA→DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录mRNA，最终获得蛋白质 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录 基 因 枪 法：适用于单子叶植物，但成本高 花粉管通道法：简便经济 1、导入到植物细胞常用的方法有农杆菌感染法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单子叶植物）和花粉管通道法 2、导入到动物细胞常用的方法是显微注射法 3、导入到大肠杆菌时先用Ca2+处理成感受态，后与溶有载体DNA的缓冲液混合,吸收DNA分子,完成转化 标记基因 终止子 是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？ 道理何在？ 主要考虑以下几方面的因素。 （1）基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。 （2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。 （3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 填空：基因表达载体的构建 —— 核心 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 质粒 DNA分子 限制酶处理 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） —— 核心 同一种 基因表达载体的构建 图解 将所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？ 提示：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。 第三步 将目的基因导入受体细胞 转化 —— 方法 将目的基因导入 植物细胞 将目的基因导入 动物细胞 将目的基因导入 微生物细胞 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 ——显微注射法 ——感受态细胞 目的基因进入_________内，并且在 受体细胞内维持_____和_____的过程 受体细胞 稳定 表达 将目的基因导入植物细胞的方法： 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法 程序：先提纯目的基因，再体外注射入卵细胞或受精卵中，最后将含目的基因的受精卵移植到输卵管或子宫中发育成新个体。 方法：显微注射法 将目的基因导入动物细胞 将目的基因导入微生物细胞 （1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？ 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞. 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 第二步使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 第三步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于