第四章目的基因的分离2.ppt

二、利用PCR扩增目的基因 1.巢式PCR(nested PCR) 巢式PCR是指利用两对PCR引物（巢式引物）进行两轮PCR扩增反应。 在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。 由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的序列很少）增加了扩增的可靠性和敏感性。若用于检测则可增加检测的可靠性。 2.反向PCR(Inverse PCR) 用反向的引物来扩增两引物以外的DNA片段, 对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 应用： （1）用于测序的DNA大片段的克隆 （2）获得启动子序列 （3）小质粒的定点突变 （4）鉴定插入失活基因或体内诱导基因 3.不对称PCR(asymmetric PCR) 引物浓度不相等，比例为50:1或100:1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。 不对称PCR的关键是控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。 产生的单链DNA主要用于DNA测序。 4.锚定PCR(anchored PCR) 通过添加锚定引物接头的方式来扩增合成未知序列或未全知序列,用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（Poly G）的尾巴，然后分别用多聚dC(Poly C)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚定引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来。 5.长程PCR(long and accurated PCR, LA PCR) 选用TaKaRa的LA Taq DNA聚合酶或Ex Taq DNA聚合酶。 具有3’→5’校对功能，可信度高。扩增长度长。 7. Alu PCR Alu序列是人类基因组中的高度重复序列，遍布于全基因组中，两个Alu序列间隔约4 kb。根据Alu序列的高度保守区域设计引物，扩增Alu重复序列间的未知区域的PCR称为Alu PCR。 设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。 差示PCR,differential PCR,d-PCR d-PCR可以定量检测标本靶基因的拷贝数。将目的基因和一个单拷贝的参照基因置于一个试管中进行PCR，电泳分离后呈两条区带，比较两条区带的丰度，或在引物5’端标记上放射性同位素后，通过检测两条区带放射性强度即可测出目的基因的拷贝数。 现在的PCR定量方法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量，即荧光定量PCR。 免疫PCR(Immuno PCR) 免疫PCR是一种抗原检测系统，将一段已知序列的DNA片段标记到抗原抗体复合物上，再用PCR扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段DNA分子，电泳定性，根据特异性PCR产物的有无，来判断待测抗原是否存在。 免疫PCR集PCR的高灵敏度与抗体和抗原反应的特异性于一体。其突出的特点是指数级的扩增效率带来了极高的敏感度，能检出浓度低至2 ng/L的抗原物质，为现行任何一种免疫定量方法所不及。 免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分的免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附试验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测，抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中，首先用待测抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相应的特异抗体，于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物，蛋白A-链亲合素(ProteinA-Streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合，而链亲合素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA)(Biotin-pUC19)中的生物素反应，从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来，就是第二步中的PCR过程，第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下，可经PCR在几小时内而放大数百万倍，PCR产物的多少与