层析技术.ppt-上海交通大学医学院医学检验系.ppt

倪培华-检验系-凝胶层析 蛋白质分离技术-层析 上海交通大学医学院 倪培华 副教授 一、概述 1、定义 层析(又名色谱) 一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。 1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带; 1970s早期 高效液相色谱法（HPLC) 目前 气相层析仪和HPLC与色谱、质谱以及计算机联用。 层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。 2.按层析的机制可分为 吸附层析 分配层析 凝胶层析 亲和层析 离子交换层析 （1）吸附层析 定义 指混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不同物质的吸附力而使混合物分离的方法。 原理 在不同条件下，吸附剂与被吸附物之间的作用 物理作用的范德华吸附：无选择性，吸附速度快，吸附的过程是可逆的 化学吸附：由原子价力的作用引起。有选择性，吸附速度较慢，不易解吸 吸附层析 常用的吸附剂 （2）分配层析 ——利用不同组分在流动相和固定相中的分配系数不同而进行分离的方法。 柱层析 进样量大且容易回收 薄层层析 小量样品，快速， 操作简便 三.层析的一般原理 1.分配系数 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定相）中分配程度。 纯化生物物质的纯度 取决于混合物中各组分K 值的差异程度。 混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易地把混合物中的生物物质分离。反之,K值相差较小,不易把混合物中的生物物质分离。 凝胶层析Gel Chromatography 一、基本原理 固定相（凝胶） ——三维空间网状结构 凝胶层析过程的数理关系 1、柱床体积(VT) 2、洗脱体积（Ve） 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱液的总体积。 3、外水体积（V0） 4、内水体积（Vi） 5、凝胶干体积（Vg） ?三.凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定。 2. 操作条件较温和。 3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化。 四、凝胶层析的缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低。 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制。 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用。 五、凝胶的结构与性能 1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成 （商品名为Sephadex） （1）结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙 烷使葡聚糖之间通过醚键交联 聚合而成的三维空间网状结构。 （2）特点： 交联度： 交联剂越多 交联度越大 网孔结构越紧密 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松 化学性质： 稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂, 耐热耐碱不耐强酸 （2）特点： Sephadex的分级范围 G10 700 G15 1,500 G25 1,000 ~ 5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000 吸水性 G类的型号 表示每克干凝胶吸水量（ml）x10 如G-50 每克干凝胶吸水量为5ml。 大孔凝胶 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒。 六.其它条件选择 1.柱的选择 柱短而粗,则易使样品稀释,柱长而窄,则柱的管壁效应较大,会造成拖尾现象。 测分子量 2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口； ※加样时尽量不要破坏凝胶面； ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。 亲 和 层 析Affinity Chromatography? Ni Peihua 一、原理 亲和层析是利用生物大分子所具有的专一亲和力而设计的纯化技术。 寻找配基 使配基固定化 制成亲和层析柱 吸附 解吸 酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗体： 抗原，病毒，细胞 细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝