大鼠背根节细胞原代培养.docxVIP

大鼠背根节细胞原代培养⒈16mm2盖玻片置于70%酒精中浸泡2h，之后用擦镜纸擦拭干净，晾干，锡箔包裹，高温高压蒸汽灭菌20min；⒉将1/200多聚赖氨酸（30-35μl）滴于盖玻片中央，不能超过盖玻片边缘，盖玻片置于小培养皿内，小培养皿再置于大培养皿内，大培养皿放置在水盒内，于CO2培养箱内孵育12h；（1/200多聚赖氨酸的配制：300μl水中加入1.5μl多聚赖氨酸，水盒内需保持足够的湿度，即在盒盖上可以看到明显大水珠）⒊所有解剖器械浸泡在70%（或75%）酒精中，刀片于实验开始前半小时浸泡于酒精内所有实验用具（吸头灭菌、培养皿、离心管、试管架、移液枪、解剖镜等）及超净工作台喷洒70%酒精，并于紫外灯下照射消毒；⒋配制20ml OF培养基（用前取适量2-3ml分别放置在2个一次性小培养皿内），取适量4°C预冷的PBS于2个一次性小培养皿（漂洗脊柱）和1支30ml离心管内（稀释器械上的消毒酒精）；（20ml OF：18ml optimum基础培养基+2ml 10%FCS）⒌将约3周龄大鼠置于75%酒精内，消毒并溺死，从尾根处剪开皮毛，取脊柱（尾根至颈下）；⒍所取脊柱放于PBS（室温）内清洗，第一次漂洗修剪脊柱上多余的肌肉，第二次漂洗纵行剪开椎管，取出椎孔内的背根节，并放置在含有OF的培养皿内；（背根节在脊髓两侧的椎孔内，取时，应小心、一点点剥离脊髓）⒎用镊子压住背根节一侧，用刀修剪背根节，切除轴突，并将被膜撕去，余下的膨大部分移入另一含有OF的培养皿内；⒏用无针头的2ml注射器吸取背根节膨大部分，放置于15ml离心管底部，留取约300μl培养液，再加入500μl OF和4μl胶原酶（5U/ml，100×），轻弹混匀后，置于CO2培养箱内孵育40min；（也可先全部去除离心管内的OF，再加入800μl OF和4μl胶原酶，胶原酶的用量可根据配制时间的长短而酌情增减离心管在培养箱内室，可将管盖稍稍拧松一点，取出时，记得拧紧管盖！）⒐孵育的同时，取出盖玻片，吸去其上的多聚赖氨酸，加入30-35μl 1/200层粘连蛋白；（多聚赖氨酸、层粘连蛋白有增强粘附的作用）⒑去除离心管内的液体，再一次加入500μl OF和4μl胶原酶，CO2培养箱内孵育40min，期间可轻微摇晃数下；⒒吸尽离心管内的液体，用PBS清洗3次（每次1ml PBS），动作轻柔，不要打散细胞，尽量完全去除PBS后，再用胰酶清洗1次；⒓加入500μl 0.25%胰酶（450μl PBS+50μl 2.5%胰酶），置于CO2培养箱内孵育30min；（加入胰酶后，可稍稍吹打）⒔轻轻尽量吸出胰酶液体，加入少量OF进行中和，然后将OF吸出；（OF的用量没有严格的规定，可多可少，一般50μl，中和的时间大约1min，OF能很快中和胰酶的作用）⒕加入300μl OF和5μl DNase，轻轻吹打，尽量减少气泡的产生，吹打至离心管内无明显团状或棉条状物，液体呈淡乳白色混浊液；⒖于1支新的15ml离心管中加入3ml 12%BSA，并将上述细胞悬液轻轻地、一滴一滴地加于BSA液体表面，1100rpm水平离心10min；（BSA的作用：分层，可使细胞沉于管底，而细胞碎片等杂质悬浮于BSA中细胞悬液加于BSA表面后，会稍稍下沉，但迅速上浮至BSA液面上）⒗尽量吸去BSA，再加入OF，700rpm有角度离心1min；（OF的用量不定，1ml左右，目的是为了去除BSA）⒘轻轻拿出，尽量吸除液体，再加入OF，轻柔吹打细胞，以形成细胞悬液；（OF的用量依据细胞沉淀的多少和盖玻片的个数而定，一般每个盖玻片上可滴加30-50μl细胞悬液。形成的细胞悬液先于一旁静置）⒙去除盖玻片上的层粘连蛋白，用OF清洗2-3次，然后在盖玻片上滴加细胞悬液（每个盖玻片每次OF用量，大约1滴即可，最后一次清洗后，可不必立即去除OF，待细胞悬液加入之前吸去即可）⒚将培养皿置于CO2培养箱内孵育1.5-2h，然后沿着每个小培养皿壁，在盖玻片边缘缓慢加入OF培养液，CO2培养箱内孵育过夜（每个小培养皿内加入2ml OF培养液，加入的过程中，不可用力过猛，以免冲动盖玻片胶质细胞、神经元细胞在OF培养液内均可生长）⒛镜下观察背根节细胞是否贴壁生长，若贴壁生长良好，可移去OF培养液，加入仅能促进神经元生长的培养液培养液成分： NGF（7.5ng/ml）+ BDNF（5pg/ml）+ 胆固醇（1/10000）+ B27（50×）+ neurobasel A + Glutamax（100×）各成分用量：NGF（100μg/ml）0.3μl，BDNF（100μg/ml）0.1μl，胆固醇0.5μl，B27 100μl，Glutamax 50μ， neurobasel A 5ml生长一天后，培养液可以全部换下，待轴突长出来后，只能更换1