蛋白质免疫印记.pptVIP

关于印迹法 生物大分子印迹法始创于1975年，内苏格兰爱丁堡大学E.M.Southern首先提出。他将限制酶切后的DNA片段先进行琼脂糖凝胶电泳，把一张硝酸纤维素纸放在凝胶上，利用毛细作用原位凝胶中的DNA片段转移到硝酸纤维素纸上使之固定化。由于这种技术类似用吸干作品上的墨迹，使吸墨纸染上墨迹而被称为印迹法(Blotting)。 关于印迹法 1979年，Towbin等人利用电洗脱装置作为印迹动力，首先把Westernblot法用于抗原捡出，并称之为免疫印迹法(Immunoblotting)。对应于Southern(DNA分子杂交)、Northern(RNA分子杂交)。 1981年，Burnette把免疫印迹法称为Western blotting即蛋白质印迹法-Westernblot法。 主要内容 Western Blot 简介 Western blot的中文名称是：蛋白质印迹,也叫免疫印迹（immunoblotting)。是分子生物学中常用的三种印迹技术之一。目前公认的该实验技术的发明人为美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。 Western blot——蛋白质印迹 Southern blot——DNA印迹 Northern blot——RNA印迹 Western Blot 简介 Western Blot的程序是对经处理的样本（血清、培养细胞和组织匀浆）先进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)，以分离蛋白质。然后将电泳分离开的蛋白质转移至具有结合力的印迹膜上。对印迹膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。最后对膜上蛋白质进行检验。 关于Western Blot 利用抗原抗体反应来测定标本中抗原或抗体的方法称为免疫测定(Immunoassay) 检测对象：具有免疫活性的物质 反应特性：高度的特异性和敏感性 主要内容 Western blot基本原理 在电场的作用下，蛋白样品通过SDS按分子量大小分离，再转移到一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot 缺点 抗体交叉反应引发的非特异性条带 额外的二抗孵育 实验流程 实验成功要素 仪器与设备 低温超速离心机 分光光度计 电泳仪 垂直式电泳槽 电转系统 电转仪 主要内容 一、蛋白样品的提取 提取细胞蛋白多是将细胞裂解、破碎、将蛋白质释放的原理。提取蛋白质的方法很多。一般要考虑后续实验对蛋白性质的不同要求，而采用不同的裂解方法。 一、蛋白样品的提取 水溶液提取法制备总蛋白 稀盐和缓冲系统水溶液对蛋白质稳定性强、溶解度高，是提取蛋白质最常用的溶剂，但要考虑不同物种或类型的组织或细胞。 常用的中性盐是硫酸铵。常用的组织或细胞裂解液有RIPA、SDS、NP-40、Triton。还有商品化试剂盒可供选择。 一、蛋白样品的提取 有机溶剂提取法制备总蛋白 溶液中的有机溶剂使蛋白质分子间极性基团的静电引力增强，导致水化作用降低，蛋白质易聚集而沉淀出来。 有机溶剂适用于分子中非极性侧链较多蛋白质的提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 一、蛋白样品的提取 层析、色谱或电洗脱方法制备靶蛋白 一、蛋白样品的提取 裂解方法的选择 裂解方法取决于细胞的型别和待测抗原的性质： 1. 表达靶蛋白的细菌一般直接用SDS凝胶加样缓冲液裂解。 2. 酵母先用玻璃珠振荡法或酶法裂解细胞，然后制备提取液。 3. 哺乳动物组织通常可以机械分散并直接溶于SDS凝胶加样缓冲液。 4. 哺乳动物细胞可用去污剂温和裂解。如果靶抗原耐受相应抽提过程，也可在SDS凝胶加样缓冲液裂解。 一、蛋白样品的提取 细胞准备 用PBS洗两次细胞，加入细胞裂解液，用橡胶刮子刮下细胞，吸入1.5ml离心管。由于染色体DNA的释放，溶液变得很粘稠。 超声打碎染色体DNA，直至溶液不粘为止。 4℃，13000rpm，30分钟离心。分成三层：上层为油脂，中层为蛋白质，下层为沉淀。 有必要时重复上一步骤。 上清用于做SDS，如不能立即做，可将上清转入另一离心管-80℃保存。 一、蛋白样品的提取 注意事项 细胞裂解液的量 超声的频率、时间、次数。插得深不起泡沫。 检测蛋白的敏感性1－5ng,1.5mm厚的SDS－PAGE的一个孔大约上200ug的总蛋白。 只要被检测蛋白占总蛋白的1/100000,即可被检测。 未知蛋白应同时作阳性对照。 一、蛋白样品的提取 不论采用那种方法，都应遵循以下原则： 1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失。 2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂的种类很多，要根据具体情况具体选择。 3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。切勿反复冻融已制备好的样品。 二、蛋白