高效液相色谱实验__1_.docVIP

反相高效液相色潽法测定化妆品中防腐剂 实验目的 (1)??? 了解高效液相色谱仪的工作原理； (2)??? 学习评价液相色谱反相柱的方法。 实验原理 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。 评价色谱柱的性能参数主要有： （1） n　 tr为测试物的保留时间，W1/2为色谱峰的半峰宽。 （2） k’　 t0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。 (3)??? 相对保留值（选择因子）α　 k1’和k2’分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。 (4)??? 分离度Rs　 tr1、tr2分别为相邻两峰的保留时间，Wb1、Wb2分别为两峰的底宽。对于高斯峰来讲，Wb=1.70W1/2。 为达到好的分离，我们希望n、α和Rs值尽可能大。一般的分离（如α=1.2，Rs=1.5），需n达到2000。柱压一般为104? kPa 或更小一些。 实验仪器及药品 仪器：LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；10uL的注射器； 色谱柱：Shimpack VP-ODS （4.6mm i.d×150mm，5μm2%醋酸水溶液（由10mL的醋酸+490mL的二次蒸馏水） 对羟基苯甲酸甲酯（C8H8O3 ，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所） 对羟基苯甲酸乙酯（C9H10O3 ，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所） 对羟基苯甲酸丙酯（C10H12O3 ，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所） 对羟基苯甲酸丁酯（C11H14O3 ，色标5g,含量不少于99.5%，天津市光复精细化工研究所） 色谱条件 色谱柱：Shimpack VP-ODS （4.6mm i.d×150mm，5μm2%醋酸水溶液（由10mL的醋酸+490mL的二次蒸馏水）；乙醇2%醋酸水溶液（由10mL的醋酸+490mL的二次蒸馏水）；乙醇经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中。 1.2 样品的预处理：称取1.000g的化妆品于小烧杯中，加入少量的乙醇及适量的无水硫酸钠，摇匀，超声萃取15min，取上清液经5000r/min离心10min，残渣加入少量乙醇洗涤再提取，合并上清液，取上清液经0.45nm滤膜过滤后，装进10mL棕色容量瓶中，再加乙醇定溶后待用。 1.3 标准样品的配置：配制对羟基苯甲酸甲酯（根据情况不同可配置其他防腐剂）质量浓度分别为25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL的系列标准溶液。（如果无需做定量检测，只需一个浓度的标准溶液即可。）开启实验设备 2、实验步骤 2.1实验仪器检查，条件设定 检查电路连接和液路连接正确以后，接通高压泵、检测器和记录仪的电源。 开机：柱温箱——系统控制器（泵）B——系统检测器——系统控制器（泵）A； 设定操作条件为：流速0.8 mL·min－1，压力上限10? MPa?，检测波长254 nm（该仪器检测波长已固定），保留时间15min，调节基线到合适位置。 2.2样品的测定 待基线平稳后（建议观察检测器的读数显示），录入样品信息，进样。将进样阀手柄拨到“Load”的位置，使用专用的液相色谱微量注射器取5μL样品注入色谱仪进样口，然后将手柄拨到“Inject”位置，记录色谱图。 2.3用同样方法测定系列标准溶液。 2.4根据实验所得结果应用色谱软件计算色谱峰的保留时间、半峰宽，建立标准曲线，然后计算待测样品的浓度。 2.5将流速降为0，待压力降为0后关机，关机顺序与开机顺序相反。 思考题 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点？ 不同点： 一、流动相不同：HPLC为液体流动相，GC为永久性气体作流动相（通常叫做载气） 二、进样器不同：高效液相为平头进样针，气相色谱为尖头进样针 三、色谱柱长不同： （1）气相色谱柱通常几米到几十米 （气相色谱由于载气的相对分析量较低，分子间隙大，故粘度低，流动性好，组分在气相中流动速度快，因此可以增加柱长，以提高柱效）。 （2）液相色谱柱通常为几十到几百毫米 四、分析种类有差异： 气相色谱分析的对象多为（不适绝对）：分子质量小于1000，低沸点，易挥发，热稳定性好的化合物。 液相色谱：更适用于分析高沸点，难挥发，热稳定性差，分子质量较大（1000 - -2000）的液体化合物。 五：样品柱前变化不同：气相色谱的样品在柱前必须变为气体（气化室汽化），而液相色谱的样品在柱前则无变化。 六、所用检测器有差异