IL21调节免疫平衡对大肠癌细胞生长的抑制作用.docVIP

IL21调节免疫平衡对大肠癌细胞生长的抑制作用 作者：张振亚 张伟 陈学谦 安广权 单保恩 于跃明 【摘要】 目的 观察大肠癌患者和接种Colon26细胞小鼠的Th1/Th2平衡偏移情况，同时以IL21调整小鼠Th1/Th2平衡，观察调节细胞免疫平衡对大肠癌的影响。方法 随机选取30例大肠癌患者，采用流式细胞仪测定Th1/Th2细胞比值及血清中IFNγ和IL4浓度。另于小鼠爪垫内侧皮下接种高分泌IL21的Colon26/IL21细胞，对比观察小鼠肿瘤生长情况及对机体免疫平衡状态的影响。结果 30例大肠癌患者和30例正常人Th1/Th2比值分别为0.74±0.27和1.26±0.9；血清IFNγ浓度的测定值分别为（6.26±1.43）和（9.18±2.31）pg/ml；IL4浓度的测定值分别为（8.88±1.30）和（5.20±1.71）pg/ml；IFNγ/IL4比值的测定值分别为0.70±0.10和1.82±0.35，两者差异明显。接种Colon26/IL21细胞组小鼠肿瘤持续生长至16 d后逐渐缩小，小鼠血清中IFNγ浓度明显高于对照组；接种Colon26细胞组小鼠肿瘤持续生长增大，血清中IL4浓度高于Colon26/IL21细胞组；免疫平衡向细胞免疫方向转变。结论 大肠癌患者与正常人相比细胞免疫功能下降，免疫平衡（Th1/Th2平衡）向Th2型偏移；IL21可以增强Th1型细胞免疫功能，调节Th1/Th2细胞比例，纠正免疫失衡，有效发挥杀灭肿瘤细胞。 【关键词】 免疫平衡；IL21；大肠癌； Colon26细胞 　　恶性肿瘤的发生 发展 常与机体的免疫功能低下有关，调节肿瘤患者机体免疫平衡，增强其细胞免疫功能有助于改善 治疗 效果。白介素21（IL21）主要由活化的CD4+T细胞分泌的型细胞因子，能够促进T细胞、NK细胞、树突细胞的增殖、分化并能提高NK细胞的杀伤活性，加强机体细胞免疫功能。本研究旨在通过流式细胞学和ELISA方法对比观察大肠癌患者与正常人之间免疫功能的差异；并通过调节机体分泌IL21水平，观察免疫平衡状态的变化以及抑制肿瘤生长的作用。 　　1 资料与方法 　　1.1 临床实验标本的采集 　　随机选取本院院外科经病理证实的住院结肠癌患者30例，其中男17例，女13例，年龄29～74岁，中位年龄为61岁，病例排除标准：无应用任何免疫制剂；肠梗阻合并白细胞升高；无合并其他部位感染；伴乙型肝炎、类风湿关节炎、甲状腺功能亢进等与免疫相关的疾病；对照组30例均为健康人，男17例，女13例，年龄28～70岁，中位年龄为63岁，与大肠癌患者在性别、职业、年龄等方面均具有可比性（P﹥0.05）。标本采集均为空腹静脉血。血标本分成两部分：A用促凝管采血1 ml，1 500 r/min离心10 min，提取血清，80℃保存备用；B用EDTAK2抗凝的无菌试管采血1 ml，采血后即刻送实验室进行实验。 　　1.2 实验动物、细胞株 　　清洁级Balb/c雌性小鼠共90只，体重25 g左右,均购自河北医科大学实验动物中心（合格证编号：701147）。小鼠结肠低分化腺癌Colon26细胞株、转染IL21基因的Colon26细胞株（Colon26/IL21细胞）由本院科研中心单保恩教授惠赠。 　　1.3 主要仪器及试剂 　　EpicsXLⅡ型流式细胞仪，NU400400E超净工作台，倒置显微镜，高速低温离心机，CHIBITAN型微量离心机，凝胶成像分析系统 ，UV2201型紫外分光光度计，DFCII型电泳仪，80℃超低温冰箱，PCR扩增仪，酶联免疫检测仪。人IFNγ、IL4、小鼠IFNγ、IL4定量ELISA试剂盒由晶美生物工程有限公司（北京）提供；FITC标记的抗CD4单抗（CD4FITC）、PE标记的抗IL4单抗（IL4PE）、PE标记的抗IFNγ单抗（IFNγPE）、佛波醇乙酯、离子霉素、蛋白转运抑制剂由美国BD公司提供；0.1%Triton X100由美国Sigma公司提供；RPMI1640培养基由Gibco公司提供；Trizol 由Invitrogen 生物技术公司提供；RTPCR酶混合物由华美生物工程公司提供；小鼠IL21基因上、下游引物由华美生物工程公司合成，上游引物为5＇GAGGACCCTTGTCTGTCTGG3＇，下游引物为5＇TCATCTTTTGAAGGAGCCATTT3＇；DNA Marker由北京鼎国生物公司提供。 　　1.4 结肠癌患者外周血Th1、Th2细胞检测 　　取患者抗凝血1 ml，以PMA、离子霉素为刺激原，加蛋白转运抑制剂后培养，裂解红细胞后洗涤后弃上清，CD4FITC单抗标记洗涤，加4%多聚甲醛固定， 0.1%Triton X100缓冲液破膜加入IFNγ