多重耐药大肠埃希菌基因分型及其与耐药表型的关系.docVIP

多重耐药大肠埃希菌基因分型及其与耐药表型的关系 作者：李彬， 黄心宏， 傅蔷， 曹颖平， 潘玉红 【摘要】 目的 分析福州地区临床分离的多重耐药大肠埃希菌的基因型及其与细菌耐药表型的关系。 方法 收集临床分离的多重耐药大肠埃希菌88株，采用KB法进行药敏试验，多重PCR法进行基因分型。 结果 多重PCR法可将大肠埃希菌分为4个基因型，其中检出D型42株，B2型17株，A型17株，B1型12株。4组基因型对阿米卡星、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和妥布霉素的耐药率差别有统计学意义(P0.05)。 结论 多重耐药大肠埃希菌对多种抗生素具有很高的耐药性。基因分型以致病性较强的B2型与D型为主，应采取相应措施预防院内感染。 【关键词】 大肠杆菌O157;药物耐受性; 聚合酶链反应;基因型;序列分析 大肠埃希菌是 医院 感染最常见的革兰阴性条件致病菌，可在医院环境中长期存在，尤其当患者免疫力低下时，常引起泌尿系统、下呼吸道、胃肠道、手术切口及烧伤感染和菌血症，病死率高。近年来医院获得性感染的发病率逐年上升，且由于抗生素的不合理应用和耐药基因的广泛播散，大肠埃希菌对抗生素的耐药问题日益突出，多重耐药临床分离株愈发常见。笔者对临床分离多重耐药大肠埃希菌进行遗传分型，以期获得流行病学资料，便于进一步研究。 　　 1 材料与方法 　　1.1 菌株 收集检验科2008年8月-2009年2月临床分离的多重耐药大肠埃希菌共88株，标本来源包括痰、尿液、胆汁、创面分泌物、血液等。多重耐药菌定义为对任何不同三种类型以上抗生素耐药的临床分离株[1]。 　　1.2 仪器及试剂 常规药敏纸片氨苄西林每片10 μg、氨苄西林/舒巴坦每片20 μg、阿米卡星每片30 μg、环丙沙星每片5 μg、左氧氟沙星每片5 μg、亚胺培南每片10 μg、复方新诺明每片25 μg、妥布霉素每片10 μg、哌拉西林/他唑巴坦每片100 μg/10 μg、头孢唑啉每片30 μg、头孢呋辛每片30 μg、头孢曲松每片30 μg、头孢他啶每片30 μg、头孢噻肟每片30 μg、头孢吡肟每片30 μg、头孢噻肟/克拉维酸每片30 μg/10 μg、头孢他啶/克拉维酸每片30 μg/10 μg均购自英国Oxid公司;基因分型引物、dNTP Mix(10 mmol/L)、Taq酶、琼脂糖、Loading Buffer(6×)、Marker(100～600 bp)均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。MH琼脂、伊红美蓝琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司。PCR扩增仪(美国BIORAD公司);全自动细菌鉴定仪(VITEK60型，法国梅里埃公司)。 　　1.3 质量控制 质控菌株为卫生部临检中心的大肠埃希菌ATCC 25922。 　　1.4 方法 　　1.4.1 菌株鉴定 采用全自动细菌鉴定仪鉴定菌株。 　　1.4.2 药敏试验 采用KB法，判断结果 参考 美国临床和实验室标准协会CLSI标准[2]。 　　1.4.3 多重PCR 引物参照 文献 [3]煮沸法提取细菌DNA作为模板进行扩增。反应体系为总体积20 μL，引物各为1 μmol/L，dNTP Mix 200 μmol/L，Taq酶2.5 U，模板2 μL。循环参数为94 5 min→94℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，共30个循环，最后1次延伸时间为7 min。引物序列及产物长度见表1。扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳后观察结果。表1 多重PCR引物序列 　　1.4.4 基因分型 根据多重PCR扩增产物的电泳结果，按照图1进行分型[3]： 　　chuA、yjaA和TspE4.C2为多重PCR检测的目标基因; A、B1、B2和D分别表示大肠埃希菌的四个基因型. 　　1.5 统计学处理、采用WHONE T4.0软件分析数据。根据遗传分型结果分为A、B1、B2、D四组，采用行列表资料的χ2检验对药敏结果的数据进行分析，P0.05为差别有统计学意义。 　 　2 结 果 　　2.1 多重耐药大肠埃希菌耐药谱分析 多重耐药大肠埃希菌除对亚胺培南全部敏感外;对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐药率14%，可作为除亚胺培南之外的临床经验性用药首选;对其他常用抗生素的耐药率均60%;其中头孢菌素、氟喹诺酮类耐药率高达80%以上(表2)。　表2 多重耐药大肠埃希菌药敏情况 　　2.2 基因分型 采用多重PCR分析88株多重耐药大肠埃希菌，根据PCR产物片段大小结合图1的判读标准进行基因分型得出结果(图2)。本研究中的大肠埃希菌检出D型占总数47.73%(42/88);其次为A和B2型，各占19.32%(17/88);B1型最少，占13.63%(12/88)，说明次实验收集到的多重耐药大肠埃希菌中，大多数存在较强的致