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酶联免疫吸附试验的一些体会 检验科 常会忠 包被用抗原 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的。 脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 加样 温育 洗板 ELISA加样量小（5-100ｕl），其准确性直接影响实验结果，一般应在±10%以内。 要先加稀释液后加样本 温箱实测温度是否准确，允许有±1℃的误差； 洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul ，人工扣板时，垫纸不湿 。 显色 加入顺序 HRP的底物 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 10-15分钟，根据临界值质控血清吸光度值达0.2左右使的时间而恒定反应时间. 结果判读 定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方式报告 。 阴阳性对照测定值 的有效性。 精密度：ELISA试剂一般指其批内CV，其值应小于15%。 结果判读 Cut Off的计算公式以试剂盒说明书的为准常见的有： A）??C.O=2.1×N（当N不足0.05时按0.05计）， B） C.O=0.5×N，从抑止率公式换算而来 C） C.O=N+C（C为常数），用于间接法。 D)??? C.O=C×P+N（C为常数），用于间接法。此公式最客观， 结果判读 灰区的设置有： 1）C.O×（1±CV）， CV为该试剂的批内CV (一般在15-20%间）； 2）C.O±2s，s为实验室做室内质控的SD。 3）0.7C.O《样本OD《1.4C.O 参考标准品 荷兰输血中心实验室（CLB）：血型、病毒学、自身抗体等。 丹麦国家血清研究院（SSI）：病毒学、寄生虫、免疫蛋白等。 美国BBI：HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV-1等Panel * 免疫吸附剂 ELISA 的步骤和注意事项 ELISA的相关知识 免疫吸附剂 固相载体--聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯--聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。 将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被(coating)。 包被方式 包被用抗体 IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。 包被的条件 pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时。 封闭 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶。 所有的ELISA固相均需封闭。 参考标准品 英国国立生物学标准及控制品研究院（NIBSC）：免疫血清学 IU/ML 德国鲍尔-艾立希研究院（PEI）：病毒学、免疫血清学等，传染病标志物最全PEI/ML。 法国国家中心实验室（LNS）、法国输血协会（SFTS）：病毒性肝炎、艾滋等血清盘。NG/ML 谢谢