5.酶的固定化与酶反应器.ppt

主 讲 人：孙利芹 第三章 酶的固定化与酶反应器 提 纲 §3.1 引言 §3.2 酶的固定化 §3.3 细胞的固定化 §3.4 固定化酶与固定化细胞的应用 §3.5 酶及固定化酶反应器 第一节 引言 酶的应用受到限制的原因 1953年，德国人采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮法活化后分别与羧肽酶、淀粉酶等结合制成不容与水的固定化酶 60年代后期，固定化技术迅速发展。1969年，日本千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨基酰化酶生产L-氨基酸； 1978年，日本人用固定化枯草杆菌细胞生产α-淀粉酶； 1982年，日本首次研究固定化原生质体生产谷氨酸取得进展 在我国，华南理工大学在固定化技术方面有些研究。1984年，郭勇等人首次应用固定化细胞生产α-淀粉酶、糖化酶和果胶酶研究；1986年，应用固定化原生质体生产碱性磷酸酶取得成功 (作业：综述我国固定化酶技术的研究进展及应用概况) 第二节 酶的固定化 固定化酶的定义 固定化酶的制备原则 酶的固定化方法 固定化酶的性质 辅酶的固定化 一、基本概念 所谓固定化酶指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收利用。 固定化所采用的酶，可以是经提取分离后得到的有一定纯度的酶，也可以是结合在菌体(死细胞)或细胞碎片上的酶或酶系。固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体，它是固定化酶的一种形式。在固定化细胞(活细胞)出现之前，也有人将固定化菌体称为固定化细胞。 优点： ①极易将固定化酶与底物、产物分开； ②可以在较长时间内进行反复分子化反应和装柱连续反应； ③大多数情况下能提高酶的稳定性； ④产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； ⑤酶的使用效率高，成本降低。 缺点： ①固定化时酶活力有损失，如交联的枯草杆菌蛋白酶晶体 水解氨基酸酯的活力比可溶性酶低96.4% ，然而固定化 的脂肪酶合成酶的活力比游离酶增加40倍； ②增加了生产的成本，工厂初始投资大； ③只能用于可溶性底物，而且适用于小分子底物，对大分 子底物不适合； ④与完整菌体相比，不适宜于多酶反应，尤其是需要辅 助因子反应； ⑤胞内酶必须经过酶的分离手续。 制备固定化酶要遵循几个基本原则： 必须注意维持酶的催化活性及专一性； 固定化应该有利于生产自动化、连续化，为此载体必须有一定的机械强度； 固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近； 酶与载体必须牢固结合，有利于回收、反复利用； 应由最大的稳定性，所选载体不与底物、产物反应； 成本低，有利于工业使用。 非共价结合法 化学结合法 包埋法 逆胶束酶反应系统 热处理法 非共价结合法 结晶法 就是使酶结晶从而实现固定化的方法。晶体酶提供了高的酶浓度，对于活力较低的酶来说具有优越性。 局限性：不断的重复循环中，酶会有耗损。 物理吸附法 利用固体吸附剂将酶吸附于其表面而使酶固定化的方法。 常用的载体：☆无机载体：多孔玻璃、活性炭、漂白土、硅胶； ☆天然高分子载体：淀粉、胶原蛋白等； ☆大孔树脂 离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。 载体： ☆阴离子交换剂：DEAE-纤维素、 DEAE-葡 聚糖凝胶等 ☆阳离子交换剂：CM-纤维素 以固定化氨基酰化酶为例 将处理成一OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加至含有氨基酰化酶的0.1mol／L的pH.7.0磷酸缓冲液中，于37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。 将处理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处理，使之成为OH型，用无离子水冲洗，再用pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶溶于pH7.0的0.1m01／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液，在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰-DL—氨基酸，生产L—氨基酸。 化学结合法 1.共价结合法 ——酶与载体以共价键结合的固定化方法 ◆酶分子中可