RNA样品的制备和检测.docVIP

RNA样品的制备和检测 用trizol提取细粒棘球蚴的总RNA mRNA的纯化 利用Invirtrogen的Oligo(dT)25磁珠进行mRNA纯化，具体步骤参照其说明书。 反转录第一链的合成 按照PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit说明书进行PCR反应 反转录第二条链的合成 在cDNA第一链合成物混合物中加入51ul超纯水，加入20ul 5X second strand buffer和3ul dNTP mix (10mM),在冰上放置5min，然后加入1μLRNaseH(2U/μL)和5μL DNA pol 1 (10 U/μL)混匀后，置于16℃2.5小时，按照QIAquick PCR Purification Kit说明书进行纯化，最后将样品溶于35μL EB溶液中。 末端修复 取上一步纯化后的DNA35 μL ，加入50μL T4 DNA ligase buffer(2*)、4μLdNTPs mix、T4 DNA polymerase、Klenow DNA polymerase和T4PNK,在20℃条件下反应30min，利用OIAquick PCR Purification Kit进行纯化后将样品溶于EB溶液中 3，末端加A 取上一步纯化后的DNA Klenow buffer，加入Klenow buffer、dATP、Klenow exo-，在37℃下反应30min，然后用PCR纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于EB溶液中。 加衔接头 取上一步纯化后的DNA加入T4 DNA ligase buffer、Adapter oligo mixa和DNA ligase，在PCR纯化试剂盒进行纯化，最后将样品溶于EB溶液中。 连接产物的胶回收纯化 样品进行电泳，切取250bp到300bp的条带，放入称量好的eppendorf管中。按照QIAquick Gel Extraction Kit说明书进行胶纯化回收，回收产物溶于EB溶液中。 PCR PCR产物的胶回收纯化 DNA制备产物检测 利用Agligent 2100 bioanalyzer仪进行检测，检测流程参照其说明书。 DNA测序 DNA测序用Solexa测序技术完成 组装 组装时，将测序产生的short read从头组装成conting，然后把paired-end数据比对到contig上，如果有paired-end关系将两个contig连接起来，则认为这些contigs是一个scaffold的片段，这样可以将多个contigs连接成scaffold。利用reads对scaffold中的洞进行填补（gap filling），生成最终的scaffold sequence。Scaffold可以看作是转录本水平上的序列，对转录组的分析在scaffold水平上进行。 具体过程： 利用软件：solexa的soapdenovo 随即打散基因组，进行双端测序：扩增长度在150--500bp之间的短克隆，并直接测序B.将未处理（或者未经纠正的）reads读入到内存中，并且用deBruijin图数据结构来表示reads间的OverlapC.通过移除错误的连接，解决微小的重复来简化图：a.剪去短末端b.移除低覆盖度的边c.解决reads路径中得微小重复d.合并茎环：可能由于重复或者二倍体染色体组的混杂造成D.在简化图的基础上，我们在重复边界上打断连接，输出明确的序列作为contigsE.我们重新用reads和contigs进行比对，使用双端信息来把单一的单一的contigs连接成scaffoldsF.最后，我们使用配对双端resds来填补scaffolds内部可能是由重复序列所造成的Gap。希望对你理解有所帮助 对组装结果分析（Contig长度分布、Scaffold长度分布、Unigene长度分布） A CDS（编码蛋白区域）的获得：将scaffold与Nr库比对获得scaffold的CDS区域，对于没有比对到的scaffold则通过软件ESTScan预测来获得scaffold的CDS区域；蛋白功能和分类预测：将scaffold-gene和COG数据库进行比较，预测scaffold-gene可能的功能；scaffold-gene代谢通路分析: KEGG，京都基因与基因组百科全书 (KyotoEn盯 dopediaofGenesand Genomes)，是系统分析基因功能，联系基因组信息和功能信息的知识库【24，25]o KEGG主要包括四个数据库:基因组信息存储在GENES数据库里;功能信息存储 在PATHWAY数据库里;LIGAND数据库包含化学物质、酶分子、酶反应等信息; 而BRITE(BiomolecularR