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腺病毒 ——辅助病毒依赖型腺病毒载体的研究进展 疱疹病毒载体 逆转录病毒载体 牛乳头瘤病毒载体 痘苗病毒载体 腺病毒载体：Ad2和Ad5 腺病毒粒子相对稳定，病毒基因组重排率低 安全性较好，未发现与人类肿瘤的发生有直接关系 腺病毒基因组较大（36kb），插入大片段外源性基因的潜力大 宿主细胞较广泛 无包膜病毒，核衣壳呈20面体立体对称，直径70-90nm 双链DNA：被包于蛋白质外壳内 六邻体：每面12个，构成20面体的面及棱的大部分 五邻体：12个，位于20面体的12个顶点上，由基底和一根纤维突起组成（基底对细胞有毒性，有组抗原特异性；纤维突起具有吸附蛋白，介导病毒吸附至易感细胞表面） 第一代腺病毒载体：去除E1、E3区，插入外源基因的长度可达8kb； 第二代腺病毒载体：在去除E1、E3的基础上又将E2A突变或E4区缺失，允许插入最大约 14kb的外源序列； 第三代腺病毒载体：即辅助病毒依赖型腺病毒载体（Helper dependentadenovirus, HD-Ad），缺乏所有编码序列，只含有约500bp的顺式作用元件，用于DNA复制和包装；插入外源基因的序列可达36kb; HDAd的构建及制备 HDAd与免疫反应 HDAd的应用 HDAd展望 HDAd 缺失腺病毒基因组的所有编码基因 ,仅含有腺病毒基因组末端的非编码基因倒置重复序列（ITR）及包装信号 为保证载体的正常包装 ,缺失的基因组由“stuffer DNA”进行填充 ,同时克隆有相关的转基因 目前有数个 HDAd 的制备系统 ,原理和成分基本相同。在这些系统中比较成功的是由加拿大麦克马斯特大学 Graham 教授设计的 HDAd 系统 ,该系统成功降低了辅助病毒污染 ,并大大提高了载体产量 辅助病毒 辅助病毒可反式提供腺病毒载体包装和复制所必需的结构和功能蛋白 ,常是通过在第一代腺病毒载体包装信号两侧插入一种重组酶的酶切位点构建而成 根据包装细胞株中不同的重组酶类型 ,插入辅助病毒包装信号两侧的酶切位点也不同 , 例如: Cre-loxP、FLP-FRT 和φC31-attB/attP 重组系统 包装细胞株 通过在细胞染色体上整合位置特异的重组酶( site-specific recombinase) 基因序列构建而成 ,这些重组酶基因序列包括:Cre 序列、FRT序列等。 常见 的 包 装 细 胞 株 包 括 PERC62Cre 、116 、293Cre4 、293Cre415 、293FRT、293CreFRT、CreE、C72cre 、2932FLPe6 等 包装细胞株的研究主要集中在两个方向 ,一是设法获得可高效表达重组酶或能同时表达两种重组酶的细胞株 ，二是设法提高单个细胞 HDAd 的产量 HDAd在基因治疗中的应用 腺病毒对肝脏具有天然亲嗜性 , HDAd被广泛用于肝脏疾病的基因治疗 ,并获得较好的实验效果 HDAd 因具有感染非分裂细胞、转染多种组织的能力 ,以及安全等优点已被广泛用于神经系统疾病的基因治疗 HDAd 还被用于其他多种遗传性疾病的治疗 ,如:肥胖症、囊性纤维病 、糖尿病 和血友病等疾病的治疗。另外 , 在神经退行性疾病、肿瘤和心血管疾病均获得较好的实验效果 HDAd在疫苗中的应用 FGAd 因能够诱导抗腺病毒的免疫而导致应用受限。Harui用 HDAd 免疫 C57BL/6 小鼠获得了比等量的 FGAd更好的转基因特异性 CTL 和抗体反应 ,并认为转基因的高效表达引起机体产生了针对转基因的增强的免疫应答。 目前以 HDAd 作为疫苗载体的文献并不多见 ,其在疫苗中的价值还需要进一步探索。 HDAd 在 RNA 干扰的应用 为确定用 HDAd 在肝脏表达 shRNA的可行性 ,Witting设计了鼠fabp5 的 shRNA 结构，静脉注射后导致 75 %的 fabp5 不表达(沉默) 。 病毒载体 腺病毒载体的优点 腺病毒的结构特征与感染过程 70-90nm 结构特征 感染过程 腺病毒载体介绍 腺病毒载体的分类 HDAd的构建及制备 HDAd Helper virus 包装细胞株 HDAd与免疫反应 HDAd的应用