微生物生理学幻灯片(第五章).ppt

第五章 微生物的氮代谢 一、生物固氮 固氮作用 ——使氮气作为氮源而利用的过程 ，是某些原核生物的一种特性。 人工固氮——高温高压（300-600℃，200-800atm） 生物固氮——固氮酶的参与下进行，常温常压，厌氧条件下。 生物固氮的优点：经济（无需投入）；无污染（水体的富营养化、致癌、温室效应、臭氧层的破坏） 固氮微生物种类（生态类型） 1894年，维诺格拉斯基——巴氏梭菌 Beijerinck（贝哲林克）——根瘤菌属、固氮菌属。 自生固氮菌——指一类不依赖与它种生物共生而独立进行固氮的微生物。 共生固氮菌——指必须与它种生物共生在一起时才能进行固氮的微生物。 联合固氮菌——指必须生活在植物根际、叶面或动物肠道等处才能进行固氮的微生物。 地球上各种类型的固氮量 （一）、研究方法 Ahsby（阿什贝）培养基——无氮培养基进行分离培养判断（不严格、不准确、不精细？）。 乙炔还原法——利用固氮酶可以催化乙炔形成乙烯，通过气相色谱仪检测乙烯的形成及量，从而确定固氮酶的存在、活性、活力。 同位素示踪法（15N，无放射性）——质谱分光光度计测出。 Ahsby无氮培养基 甘露醇（蔗糖、葡萄糖） 10g KH2PO4 0.2g MgSO4.7H2O 0.2g NaCl 0.2g CaSO4.2H2O 0.1g CaCO3 5g 蒸馏水 1000mL 乙炔还原法测定固氮酶活性 ㈡、生物固氮机理 1、固氮酶 2、能量供给（ATP的供应） 3、还原力[H]及其传递载体 4、固氮酶催化的反应 5、固氮酶的防氧保护机制 6、固氮产物氨的同化 7、固氮酶的调节 1、固氮酶 固氮酶是一种复合蛋白，由固二氮酶（固氮酶，Dinitrogenase）和固二氮酶还原酶（固氮酶还原酶，Dinitrogenase reductase）组成。 两种（酶）蛋白成分中都含有铁（硫铁蛋白成分），而固氮酶中还含有钼。含有一个钼原子、铁原子（7个？）和硫原子（9个？），是一种小肽，称为铁钼因子（FeMo-co）。 N2的还原反应在Fe-Mo中心进行。FeMo-co的成分是MoFe7S9（MoFe7S8）+高柠檬酸，而且每分子固氮酶存在两个FeMo-co。 作为固氮酶中的铁钼辅因子FeMo-co的结构 固氮酶两个组分的比较 特殊说明 一些固氮细菌在某些生长条件下能合成无钼的固氮酶，形成所谓互生固氮酶，其不含有钼，而是含有钒（和铁）或只是有铁。 当钼充足时，互生固氮酶不能合成，因为含钼固氮酶是细胞中主要的固氮酶，推测互生固氮酶是在环境中缺少钼时仍可进行固氮作用的一种后备酶。 2、能量供给（ATP的供应） N三N叁键解离能为940kJ，O2为493kJ。 N2：ATP=1：18~24（不成比例），由呼吸、光合磷酸化或厌氧呼吸、发酵作用提供。大约每转移2个e-需要水解4~5个ATP。 生物固氮也是一个耗能过程，固定1kg氮化合物要消耗10kg碳水化合物，豆科植物光合作用获得的能量约有5~10%用于固氮。 3、还原力[H]及其传递载体 固氮反应中所需大量还原力（N：[H]=1：8）必须以NAD（P）H2的形式提供。由各种碳源物质的分解、光合作用的光反应中心Ⅱ使水光解、还原性物质（机体外——连二硫酸钠、丙酮酸等） 固氮酶中电子转移的顺序如下：电子供体→固氮酶还原酶→固氮酶→N2→2NH3。电子传递载体有铁氧还蛋白（Fd）或黄素氧还蛋白（Fld）。 用于氮还原作用的电子从铁氧还蛋白或黄素蛋白的低电位的铁硫蛋白上转移到固氮酶还原酶上。 固氮酶为得到较低的电位也需要ATP，以便N2的还原。固氮酶还原酶的氧化还原电位是-0.30V，而且当电子转移给固氮酶和此酶水解ATP时，电位降低到-0.4V。这种复合体然后与固氮酶相结合，结合后的固氮酶成为还原态，还原态的固氮酶将N2还原成NH3（反应是在FeMo-co中心进行）。 虽然将N2还原成NH3只需要6个电子，但实际上在整个反应过程中要消耗8个电子，有两个电子以H2的形式损失掉了。 固氮酶的电子供体 4、固氮酶催化的反应（6个环节） 固氮酶-固氮还原原酶-Mg-ATP复合物——完整的固氮酶。 整个固氮过程主要经历以下几个环节： ①由Fd或Fld向氧化型固二氮酶还原酶的铁原子提供1个电子，使其还原； ②还原型的固二氮酶还原酶与ATP-Mg结合，改变了构象； ③固氮酶在“FeMo-co”的Mo位点上与分子氮结合，并与固二氮酶还原