浅析新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响.docVIP

浅析新基因NOR1对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响 【摘要】 　　目的: 研究NOR1基因对肝癌细胞系HepG2蛋白质表达谱的影响。方法: 将pcDNA3.1(+)/ NOR1的表达质粒经脂质体导入HepG2 细胞, Northern blot筛选出阳性克隆, 通过双向电泳分离过表达NOR1的HepG2细胞内蛋白质, 筛选出差异表达的蛋白质点, 并进行质谱分析鉴定。结果: 鉴定出6种表达上调的蛋白质点, 包括锌指蛋白、 肿瘤坏死因子受体、 酪氨酸蛋白磷酸化受体等, 这些蛋白质涉及基因转录、 信号转导等肿瘤发生相关事件。结论: NOR1基因可能通过上调这些蛋白参与多种途径影响肝癌的发生发展。 【关键词】 NOR1基因 双向电泳 基质辅助激光解吸飞行时间质谱 　　硝基还原酶基因NOR1是课题组克隆的一个与亚硝胺类化合物致癌密切相关的新基因[1], GenBank登录号为AF462348。人体多组织Northern blot表达分析显示NOR1基因在所检测的肝、 脑、 肾、 肺、 脾脏、 骨骼肌等12种正常组织中广泛表达, 且有2个转录本(1600 bp, 1200 bp)[2]。通过构建NOR1基因真核表达载体及NOR1基因转染HepG2肝癌细胞系, 发现NOR1基因转染可引起IL8的表达升高[3, 4]。为了深入研究NOR1基因功能, 本试验运用转基因技术构建过表达NOR1基因肝癌细胞系HepG2, 采用高通量的蛋白质组技术（双相电泳, 质谱）研究过表达NOR1肝癌细胞系HepG2后蛋白质表达谱的改变, 通过对差异蛋白点的鉴定与分析, 探讨NOR1基因在肝癌发生、 发展中的作用。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 人肝癌细胞系HepG2细胞由中南大学湘雅三医院检验科保存; pcDNA3.1(+)载体为哺乳动物高效表达载体, 为Invitrogen公司的产品; pcDNA3.1(+)/NOR1载体由中南大学湘雅三医院检验科构建; 随机引物标记盒购自美国Promega公司; TRIzolTM试剂购自美国Gibcol/BRL公司; 蛋白质相对分子质量(Mr)标准购自中科院上海生物化学研究所; 同位素α32pdCTP、 α33pdATP, 购自北京福瑞公司; 引物由大连宝生物有限公司合成; 固相pH梯度干胶条（pH3～10, 18 cm）、 载体两性电解质（pH3～10）、 IPG缓冲液、 覆盖液（Drystrip cover Fluid）、 石蜡油、 银染试剂盒、 IPGphor电泳单元及双向电泳附件、 EPS 3500电源、 重泡胀附件和循环水浴箱等电聚焦系统、 IPGPhor电泳系统等购自Pharmacia公司; 丙烯酰胺（acrylamide）、 亚甲基双丙烯酰胺（Bis）为国产分析纯; 乙腈（ACN）为国产色谱纯; 其他试剂为国产分析纯试剂; 垂直平板电泳系统、 循环水浴箱购自BioRad公司; PDQUEST 2D胶分析系统购自BioRad 公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 pcDNA3.1(+)/NOR1/HepG2稳定表达系的建立 方法详见文献[3]。上游引物为5′ATG ACT TCC AAG CTG GCC GTG GCT3′, 下游引物为5′TCT CAG CCC TCT TTC AAA AAC TTC TC3′; 为了进一步验证稳定细胞系的建立, 我们还使用Northern blot方法进行了验证, 方法见分子克隆操作。 　　1.2.2 蛋白抽提与定量 细胞培养至对数生长期, 弃出培养液, 用胰酶消化, PBS洗后约2×106细胞中加入50 μL裂解液（8 mol/L urea, 40 g/L CHAPS, 40 mmol/L Tris, 65 mmol/L DTT）, 液氮反复冻融后, 加20 μL RNase(20 g/L)在4放置15 min, 13000 r/min, 4离心30 min, 收集上清液, 样品存放-70。蛋白定量用BSA方法操作, 每次上样量为300 mg。 　　1.2.3 等电聚焦电泳及银染 采用IPGphor等电聚焦系统, 把干胶条置于胶条盒中放置在IPGphor电泳仪上水化（水化液组成为: 8 mol/L urea, 5 g/L CHAPS, 2.8 g/L DTT及痕量溴酚蓝） 15～18 h, 水化完毕按500V, 1000V各1 h, 8000V 5 h等电聚焦聚焦结束后, 取出胶条, 加入平衡液A（8 mol/L urea, 0.5 mol/L TrisHCl, 20 g/L SDS, 300 g/L甘油, 1 g/L DTT）振荡平衡15 min, 再换平衡液B(8 mol/L urea, 0.5 mol/L TrisHCl, 20 g/L S