益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠TNF-α mRNA和蛋白表达的影响.docVIP

益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠TNF-α mRNA和蛋白表达的影响 作者：庞勇，冯卓，畅英才，吴刚，陈丽蓉 【摘要】 目的通过观察益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠脑内 TNF-α mRNA和蛋白表达的影响，探讨益肾调督针法 治疗 缺血性脑损伤的机制。方法采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，应用原位杂交及免疫组化方法观察脑缺血再灌注时TNF-α mRNA和蛋白表达的变化，以及针刺对其影响。结果正常组和假手术组大鼠TNF-α mRNA和蛋白在皮质区呈基础水平表达，脑缺血再灌注后 12 h TNF-α mRNA和蛋白表达增强(P0.01)，针刺可明显抑制脑缺血区皮质TNF-α mRNA和蛋白的表达 (P0.05或P0.01)。结论益肾调督针法对缺血性脑损伤的保护作用机制与针刺抑制脑内TNF-αmRNA的表达从而减少TNF-α蛋白的合成有关。 【关键词】 益肾调督针法； 脑缺血； 再灌注； 肿瘤坏死因子-α 　　肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为一种多效性的促炎性细胞因子，不仅在机体炎症反应和损伤过程中起着重要作用，而且与缺血性脑血管病关系密切。本研究使用大鼠局灶脑缺血模型，观察益肾调督针法对脑缺血再灌注后不同时间点缺血侧皮质TNF-α mRNA和蛋白表达的影响，以探讨益肾调督针法抗脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤的机制。 　 　1 动物及分组 　　选用清洁级成年Wistar大鼠150只(广西中医学院实验动物中心提供)，体质量（240±20） g，雌雄各半，随机分为正常组、假手术组、模型组、益肾调督针法组和常规针法组各30只，其中每组又分为12，24 ，48 h等3个时间段组，每时段组各10只。其中，12 h针刺组于手术后1 h针刺，处死前再针刺1次；24，48 h针刺组一日针刺两次，处死前再针刺1次。 　 　2 方法 　　2.1 动物模型的制备手术方法参照Zea Longa线栓法［1］加以改良。10%水合氯醛腹腔内注射麻醉后（35 mg/kg）,大鼠自主呼吸,手术过程中必要时追加麻醉药物。大鼠取仰卧位固定在手术台上,取左侧颈旁正中切口,钝性分离皮下组织,暴露并游离出颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉,将颈外动脉主干缝扎后,然后将颈总动脉近心端结扎,颈内动脉用微动脉夹夹闭，在颈总动脉的近颈外动脉起始部剪一小口,将准备好经过处理的鱼线头端插入颈内动脉,松开微动脉夹,将鱼线缓缓上推,直至大脑中动脉入口处（约为1.8±0.5 cm），此时可感到栓线稍有阻力。在切口稍上方结扎,逐层缝合切口，栓线于皮肤外留5 cm左右，缺血1 h后抽取线栓,造成缺血再灌损伤模型。假手术组栓线不插入颈内动脉颅内段,其余操作同以上。待大鼠麻醉清醒后观察神经症状。 　　2.2 针刺方法及模型处理益肾调督针法组:取百会、风府、大椎、命门、肾俞(患侧) 、太溪(患侧) 。方法:手捻针,百会、风府、大椎用平补平泻手法,命门、肾俞、太溪用补法,留针30 min,每5 min行针1次。常规针法组：取合谷、曲池、环跳、足三里、昆仑，均取患侧，方法：手捻针，平补平泻手法,留针30 min，每5 min行针1次。空白对照组:不予任何处理。模型组:造成局灶性脑梗死模型不做针刺治疗。 　　2.3 取材各组大鼠行相应处理到规定的时间以10%水合氯醛足量麻醉，断头处死，于冰盘上取缺血侧脑皮层组织约200 mg分为两等份，分别用于检测TNF-α mRNA和蛋白，于-70冰箱保藏备用。 　　2.4 检测方法TNF-α mRNA和蛋白测定分别应用原为杂交和免疫组化的方法进行。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，具体测定步骤严格按试剂盒说明书进行。应用北航图像分析系统，记数6个不重复高倍视野中阳性细胞数目，求平均值，用 ±s表示。 　　2.5 统计学处理应用SPSS16.0统计软件。计量资料以 ±s表示，多组样本均数比较采用方差分析。 　 　3 结果 　　各组TNF-α mRNA和蛋白表达比较。 　　见表1～2。正常组与假手术组TNF-α mRNA和蛋白的阳性细胞数表达较低，二者相比无统计学意义（P0.05）；模型组12 h皮质TNF-α mRNA和蛋白均开始表达，并且12 h TNF-α mRNA表达相对较高，以后开始逐渐下降，而蛋白表达的高峰稍延迟，出现于再灌注24，48 h后开始下降，与假手术组相比有统计学意义（P0.01）；常规针法组和益肾调督针法组相应时间点TNF-α mRNA和蛋白表达的趋势和模型组相似，但在各时间点阳性细胞表达均较模型组降低，且有显著差异(P0.05或P0.01)。常规针法组与益肾调督针法组12 h相比有显著性差异(P0.05)；常规针法组与益肾调督针法组24，48 h相比有极显著性差异(P0.01)。表明缺血后脑组织中TNF-α mRNA和蛋白的