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EASY 克隆技术 北京全式金生物技术有限公司 EASY 克隆 分子克隆的传统方法 Topoisomerase (EASY)克隆原理 EASY 克隆策略 EASY 克隆成功的关键 EASY 克隆常见问题及解决方法 分子克隆的传统方法 分子克隆的传统方法 Vaccina Topoisomerase as Cloning Tool EASY 克隆原理 EASY 克隆 利用 Vaccina Virus Topoisomerase (TOPO) ，与载体结合 (牛痘病毒的拓扑异构酶) 酶特点： ? 由314个氨基酸组成 ? 识别5’-C/TCCTT-3’ ? 同时具有限制性内切酶(nick enzyme)和连接酶的功能; 工作所需缓冲液条件宽泛 ? 不需要外界提供能量 ? 80%的连接反应在2分钟之内即可完成 EASY 克隆过程: 三个简单步骤 EASY 克隆策略——对片段的处理 EASY克隆策略——对比载体EASY 克隆和T4 DNA Ligase克隆比较（Topo载体和普通TA载体比较） EASY 克隆成功的关键 引物设计、PCR条件 克隆反应设置 克隆感受态细胞的选择 选用质量好的胶回收或PCR纯化试剂盒 （一）准备外源片段时的注意事项 引物设计：引物不能磷酸化。 PCR注意事项： ? 后