Real-TimePCR技术.pptVIP

五.RT-PCR的几种常用方法 TaqMan 法（探针法） PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 SYBR Green 法（荧光染料掺入法） 在PCR反应体系中，加入过量 SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特 异性地掺入DNA双链后，发射荧光 信号，而不掺入链中的SYBR染料 分子不会发射任何荧光信号，从而 保证荧光信号的增加与PCR产物的 增加完全同步。 荧光染料掺入法特点： 　 1、灵敏度高：使用SYBR可使荧光效果增强到1000倍以上 　　2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。 　　3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。 　　4、高通量大规模的定量PCR检测 　　5、专一性要求不高的定量PCR检测。 ? Molecular beacon 法(分子信标) 八.RT-PCR和常规PCR技术的区别 常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析