J克隆DNA的分析与应用.pptVIP

研究基因表达的调控（一） 鉴定DNA分子上蛋白的结合位点 当某一基因的转录产物的5’端被确定后，在基因组克隆上的相应位置就是转录起始点。DNA序列的上游含有控制基因时空转录的调控序列。转录因子与特异的调控序列相结合，并有助于转录起始。 主要有两种方法： gel retardation（凝胶滞后） Footprinting with DNase I（DNase I足迹法）　　 凝胶阻滞 结合蛋白后，DNA的分子量将会增加，电泳过程中，迁移率将会下降，这种方法称为gel retardation（凝胶滞后）。可被用来检测与调控序列相结合的转录因子。 图6-22 凝胶滞后原理? Dnase I足迹法 虽然凝胶阻滞能显示出蛋白与DNA分子的结合，但它并不能提供在所用片段中结合位点的序列，DNase足迹法可确定与蛋白作用的实际序列区域。 用末端标记的DNA片段与蛋白样品(如核抽提物)相混合，待相互结合后，用DNase I酶对复合物进行温和酶解，以期产生平均一个分子被切一次的产物。 在蛋白结合区域，核酸酶不能轻易接近DNA骨架，很难实现切割。将部分酶解的DNA进行PAGE电泳分析，在对照DNA的泳道中的梯状显示出所有随机的核酸酶切割部位，而在加入蛋白样品的泳道，显示出的梯状带中会有某些带的空缺。 DNA足迹分析技术可用于RNA聚合酶(蛋白质)结合序列的确定 （二）通过