Real-timePCR技术介绍.pptVIP

标准曲线法的相对定量 由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如β-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等）。 比较Ct法的相对定量 比较Ct法与标准曲线法的相对定量的不同之处于在于其运用了数学公式来计算相对量： 平均相对含量=2-平均??Ct 其中， ?Ct=Ct待测-内源控制物， ??Ct= ?Ct待测- ?Ct calibrator 前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct=1）的不同相当于起始模板数2倍的差异。但是此方法是以靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致为前提的，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。 protocol 对靶基因进行Real-time PCR评价的过程： 选择检测方法（染料或探针）：根据具体实验的需要。 基础研究主