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三种印迹技术的比较 RNA印迹技术 (Northern blotting) 2010.03.28 Northern blot 印迹杂交原理示意图 制备待测核酸样品 分离、变性、转移、固化RNA片段 预杂交 制备核酸探针 标记核酸探针 加入标记核酸探针 核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 杂交 漂洗去除未参与杂交的标记探针 检测杂交信号 （一）RNA的提取及质量检测 RNA的提取 紫外吸收检测RNA的纯度和浓度 1.取RNA样品5ul，用水稀释50-100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。 2.在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时RNA浓度=OD260×40ug/ml×稀释倍数。 3.若OD260/ OD280小于2，说明可能有DNA片段污染，可用无Rnase的Dnase处理样品。 （一）RNA的变性电泳 原理：RNA的二级结构使得RNA不能严格按 照其分子质量的大小在琼脂糖电泳中分离， 所以进行RNA电泳时，RNA必须经过变性剂 处理使二级结构解体，泳动时才能按分子质 量大小分离。 试剂：10×MOPS(0.2mol/L 3-N-吗啉-丙磺酸； 0.05mol/L 醋酸钠； 0.01mol/L EDTA）、RNA上样 缓冲液（去离子甲酰胺0.72ml；10×MOPS 0.16ml； 37%甲醛0.26ml；0.1%DEPC水0.18ml；80%甘油0.1ml ；饱和溴酚蓝0.08ml、琼脂糖、37%甲醛琼脂糖。 操作方法 1%琼脂糖凝胶的制备：1g琼脂糖，10ml 10×MOPS 加0.1%DEPC水至90ml，微波炉煮沸5min使胶溶解， 冷却到50℃，加入5mg/ml溴化乙锭5ul，混匀后倒入 平板。 RNA样品处理：取10-20ug/ml的总RNA 1ul，加入 15ul上样缓冲液溶解RNA， 95℃加热2min，使RNA 变性后，迅速放置冰浴。 用20ul的加样枪将样品依次加到样品孔， 1×MOPS 作为缓冲液，恒压3-4V/cm，3h后在紫外灯下观察结 果。 RNA琼脂糖凝胶电泳 （三）RNA的转膜 电泳后，用1×MOPS缓冲液淋洗凝胶并将凝胶浸泡于10×SSC中。 切去凝胶的无用部分并测量尺寸。将一张硝酸纤维素膜浸入水中，然后放入10×SSC中。 将硝酸纤维素膜放入20×SSC中，用20ml 20×SSC浸泡印迹垫的底部。 进行印迹，不能留有气泡。 印迹的原理为高盐溶液运输单链多核苷酸至滤膜上，微毛细管转移过程中，核酸与滤膜发生牢固的非共价结合。 Transfer system for Northern blot analysis 核酸分子杂交 定义: 两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即为杂交。 核酸探针 是指带有标记的、已知碱基序列， 能与特定的靶分子发生相互作用的DNA或RNA片段。 核酸探针的类型 （1）基因组DNA探针 :为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。 （2）c DNA探针:以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 （3）RNA探针:以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。 （4）寡核苷酸探针 探针的标记 （一）、放射性标记物 1.放射性标记物:常用的有32P、3H、35S 等放射性同位素。特点： 放射自显影技术检测，信号的强弱通过计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点： 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用   2. 非放射性标记物:常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物素（biotin）、荧光素。特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备  不存在放射性污染 1、随机引物法（random priming） 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火，使该片段随机互补结合在单链分子上，在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下，以同位素标记的dNTP为原料，寡核苷酸为引物的3’-OH端开始沿5’至3’方向，合成一条与模板互补的新DNA链。 （二）、探针的标记方法 2、切口平移法胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口，切口处形成3’-OH末端。大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用， 以另一条DNA链为模板。4种三磷酸脱氧核苷酸为原料，沿切口水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷酸同时进行，切口平行推移。