生物：基因工程的基本操作程序.pptVIP

* 一、基因操作的一般操作过程 一、基因操作的一般操作过程 （一）获取目的基因 1.目的基因：人类所需要的编码蛋白质的基因。 2.主要的方法途径： 　注1．基因文库是将生物体内的DNA全部提取出来，用适当的限制酶进行切割，然后将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说受体菌的群体中包含了这种生物的所有基因（这样的基因包含启动子、内含子等）。 　也有些基因文库较小，只包含了一种生物的一部分基因，这叫做部分基因文库，例如cDNA文库（mRNA反转录产生，并由受体菌保存。这种方法得到的基因没有启动子、内含子等）。 请比较基因库与基因文库 注2 基因文库建立时：要用________酶将提取自细胞的DNA切割，再用_________酶使这些DNA片段与载体相连，再转移到适当的宿主细胞中。 PCR技术（聚合酶链式反应技术）：利用___________酶等在体外对目的基因进行扩增。 逆转录法：在生物体外，用_______酶等合成目的基因。 根据已知氨基酸序列化学合成：在生物体外，用_________酶等合成目的基因。 限制性内切 DNA连接 热稳定DNA聚合 逆转录 DNA聚合 ［思考］：1. 从基因文库中获取目的基因的根据是 A．基因的核苷酸序列 B．基因的功能 C．基因的转录产物m RNA D．以上都是 D 2. PCR技术（DNA聚合酶链式反应技术）其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制（如下图），在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答： （1）加热至90-95℃的目的是使DNA样品的____键断裂，这一过程在生物体细胞内是通过______酶的作用来完成的。 （2）当温度降到55-60℃时，引物与模板单链末端结合；再加热至70-75℃，在‘热稳定DNA聚合酶’的作用下，引物沿模板延伸，最终合成新的DNA，此过程中的原料是____________。通过分析得出新合成的DNA分子中，A=T，C=G，这个事实说明DNA分子的合成遵循_______________。新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是_____________________和__________________________。 氢键 解旋酶 脱氧核苷酸 碱基互补配对原则 以模板DNA分子的每条链为模板进行半保留复制 复制过程中严格遵循碱基互补配对原则 只能沿一个方向， 两条引物延长的方向相向 　1.PCR仪中要加入什么？ 　2.想使DNA数量不断增多，要加入过量的模板DNA吗？要加入过量的热稳定DNA聚合酶吗？ 需要过量加什么？　 模板DNA、热稳定DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、脱氧核苷酸、引物等 注：对目的基因特异性的引物对——分别与母链一端互补的两种引物 　　　这两种引物间碱基互补的碱基越少越好（否则引物间碱基配对而失效） 　　　同一引物内也尽量不要出现碱基互补（否则自身折叠碱基配对而失效） 脱氧核苷酸、引物 要不要加脱氧核糖、碱基？ 否 　3.PCR与细胞内DNA复制有何不同？ 不需要解旋酶、 需要热稳定的DNA聚合酶、 完全形成单链再合成子链 PCR中引物用DNA单链片段，体内DNA复制引物为RNA片段 不需要ATP（但需要能量——控制温度变化） 引 物 Ａ 引 物 Ｂ 假设只一个模板DNA开始PCR，从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_____。 假设只一个模板DNA开始PCR，从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_____。 7/8 A B A A B A A B 　该PCR引物与模板链并不在最末端配对，在第____轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 三 　该PCR引物与模板链并不在最末端配对，在第____轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。 （3）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。其过程是：提取某生物的DNA，用限制酶处理后，再用___________将获得的DNA片段连接成环（如图）以此为模板，从图中A、B、C、D四种单链DNA片断中选取________作为引物进行扩增，得到的片断将用于获取该基因的全序列信息。 DNA连接酶 B、C 引物延长方向 （二）制备重组DNA分子（基因表达载体的构建） 目的基因－目的基因、　载体－载体、　目的基因－载体 生物体外、人工控制 思考：目的基因（对真核基因通常只是编码区的外显子）与启动子、终止子的位置关系？ 目的基因在启动子与终止子之间 不能转录为信使RN