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实验七：PCR基因扩增 和琼脂糖凝胶电泳实验 李卫芳 王秀海 陈黎 1 目的要求 1.1掌握PCR ，DNA扩增技术的基本原理。 1.2了解影响PCR反应的因素，能够设计PCR引物及PCR反应步骤。 1.3 熟悉相关操作及PCR仪的使用。 1.4掌握琼脂糖凝胶电泳实验 Polymerase Chain Reaction (PCR)Polymerase Chain Reaction (PCR) 2. 实验原理 多聚酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR) 由年由K. MullisK. Mullis及同事设计并研究成功及同事设计并研究成功。。 其原理类似于DNA的天然复制过程，即将待扩增的DNA片段和 与其两侧互补的两段寡聚核苷酸引物，经变性，退火和延伸若 干个循环后，一至几个拷贝的DNA分子可以扩增至数千至上百 万个拷贝。 n • DNA扩增倍数可达2 倍。可用公式 y (l十X) n 表示，式中y ＝DNA扩增倍数，X 扩增效率，循环数为n 如X 100%, n 20时， y 1048576倍。 扩增体系所含组分： • 模板DNA: 含有待扩增DNA片段的双链DNA分子， • 引物：确定待合成DNA在模板上的位置，提 DNA 聚合酶起始DNA合成的3’-OH，一对合成DNA引物确定 一个DNA片段 • 四种脱氧单核苷酸 (dNTP) ：合成DNA所需的反应 底物 • 耐热TaqDNA聚合酶：DNA合成工具酶 • 适当的缓冲体系并有Mg2+存在 PCR实验流程简述如下: 1. 加热使模板DNA在高温下 (95℃) 变性，双链解链，这是所谓变 性阶段。 2．降低溶液温度，使合成引物在低温 (55℃)与模板DNA退火互补 形成部分双链，这是退火阶段。 33 ．．溶液反应温度升至中温溶液反应温度升至中温((7272℃℃))，，在在TaqTaq酶作用下酶作用下，，以以dNTPdNTP为原为原 料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后 延伸为两条双链，这是延伸阶段。 如此重复，改变反应温度，即高温变性，低温退火，中温延伸三 个阶段。这三次改变温度为一个循环。每循环一次，使特异区 段基因拷贝数扩大一倍，一般30次循环，基因放大数百万倍。 影响PCR的几个因素 1. 循环中涉及的反应温度和时间 A.TaqDNA聚合酶耐高温 B. 如果实验中温度低于95℃，对DNA变性有很大影响 C. 严格规定引物退火温度 D. 72℃是引物延伸条件 2.2.多聚酶浓度多聚酶浓度：：0.50.5--55 UnitUnit之间之间 3.镁离子浓度：镁离子浓度可影响引物退火、模板和PCR 中间产物的链解离、产物特异性、引物二聚体生成及酶活性 等 4.平台效应：指PCR循环后期，合成产物到达到0.3－l pmol水平，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速度变成 平坦曲线。 GI Gene Primer design P1: 5 ′-AAACATATGAGCTACCAGCCCACCCCCGAG-3 ′ Nde I P2: 5 ′-AAAGGATCCCTAGCCCCGCGCGCCCAGCAG-3 ′ BamH IBamH I P1 primer has an NdeI restriction site P2 primer has an BamHI restriction site 从GenBank 中调出目标蛋白分子的genome或cDNA 编码序列 用NCBI中 Entrez 的Search功能获得DNA序列： ① /Entrez/ ② 进入网页后在Search栏中选Protein或Nucleotide，在Search for 栏中输入需要检索的蛋白质及物种的名称栏中输入需要检索的蛋白质及物种的名称，， 点击点击 GoGo