DNA分子遗传标记在中药中的应用.pptVIP

DNA分子遗传标记在中药中的应用 DNA分子遗传标记 广义的分子标记（molecular marker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。常用的是狭义的分子标记概念，即DNA分子标记。DNA分子标记主要分为以下三类 一、限制性片段长度多态性（RFLP）：是发展最早的分子标记技术，以分子杂交为核心技术。 二、DNA序列测定 三、基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。 随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA,RAPD）。随机引物扩增PCR（Arbitrary Primer-PCR,AP-PCR） 2、DNA扩增产物指纹分析（DNA amplification fingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（5～8个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3、特征扩增区段测序（Sequence-characterized amplified regions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。 RFLP技术及其应用 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性内切酶切片段长度多态性)是70年代发展起来的DNA片段分析技术。该技术不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用，而且在中药材品种基源及其地理品系、栽培品系的质量评价方面也有许多应用。 基本原理 生物在进化过程中，由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism,简称RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Enzymes cut DNA at specific sequences Restriction sites are often palindromes: 6-cutter GAATTC 4-cutter TCGA CTTAAG AGCT DNA多态性根据其产生的两种基本方式 碱基对突变类型(基因点突变),即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换(转换或颠换)，使原有切点消失或产生新的切点。 结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的 。 RFLP与镰状细胞贫血 基本实验步骤 靶DNA的准备 核酸探针的标记 杂交显示 RFLP的优点及局限性 优点： (1)普遍存在 (2)稳定性 (3)共显性 (4)探针与限制酶的组合数量无限 局限性： （1）用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变 （2）步骤多，工作量大，而且接触的放射性污染也多 （3）RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别 （4）限制性内切酶价格较贵 RFLP用于亲缘关系分析 RFLP在中药材鉴别中的应用 （一）近缘种的鉴别 如：海马的PCR-RFLP分析 （二）药用植物亲缘关系的研究 如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生 物碱分布的关系 RAPD技术及其应用 RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。该技术高效、灵敏、简便、快速，一经出现就被普遍用于物种种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的基因筛选、农作物育种等研究领域。近年，RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域，并得到广泛应用，已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术。 RAPD技术基本原理 RAPD的核心技术是PCR反应，但又不同于经典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，Williams称之为RAPD，引物通常为10个碱基；Welsh称之为AP-PCR(Arbitrary Prim