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6.2.3植物基因敲除技术 T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因“失活”。 T-DNA：根癌农杆菌Ti或Ri质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组中，是植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体。 a.引物设计。LP和 RP分别代表插入基 因两端的引物，LB 是指载体上的一段 引物，目的基因片 段(设为900bp)。旁 邻序列是经测序后 获得的DNA序列。 b，PCR产物电泳结 果。分别代表野生 型、杂合子和纯合 子PCR条带。 意义： 因为T-DNA无专一整合为点，在植物基因组中发生随机整合，所以，只要突变株的数目足够大，从理论上就可能获得任何一个功能基因都发生突变的基因敲除植物库。 因为拟南芥基因组冗余序列少，基因密度高，几乎每一个DNA插入都会导致某个基因功能的丧失，结合已完成的拟南芥基因组信息，人们很容易筛选到新的功能基因。 6. 3. 5 RNAi（RNA interference, RNA干涉）技术及其应用 RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的论文。 研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA（ssRNA, single-stranded RNA）的降解。 经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA），并有效地定位目标mRNA。 RNAi作用机制示意图。 1、 DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端 的主要生物学意义是什么？ 2 、 cDNA合成时的方向性是如何实现的？说 说构建cDNA文库的主要流程。 3、说说载体三要素及其主要改进过程。 4、SNP的概念、分类与主要检测方法。 5、请说出蓝白斑筛选的分子机制。 6、5’和3’RACE的主要技术流程。 7、PCR的主要应用途径及基本原理。 8、Gateway大规模克隆技术的原理及基本 过程。 9、基因图位克隆法的原理和过程。 10、说出基因操作与基因工程技术的异同。 11、说出蛋白质组学的基本概念和主要技术手 段，说出基因组与蛋白质组的主要差别。 12、蛋白质免疫印迹实验的原理和过程。 第 六 章 分子生物学基本研究法 （下）基因功能研究技术 6. 1. 3 原位杂交技术 原位杂交( In Situ Hybridization，ISH) 是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体原位杂交两大类。 RNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。 mRNA的互补链，杂交信号集中于纤维细胞中。 负对照，mRNA的同义链, 无杂交信号。 正对照，UBQ10 杂交信号遍布于整个胚珠。 Ji S.J. et al. (2003) Isolation and analyses of genes preferentially expressed during early cotton fiber development by subtractive PCR and cDNA array. Nucleic Acids Res. 31: 2534-2543. Expression pattern of BARD1 In Situ hybridization Han P, Li Q, Zhu YX. (2008) Mutation in the Arabidopsis BARD1 BRCT Domain Releases WUSCHEL Expression from the Organizing Center. The Plant Cell 20: 1482-1493. 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH). 对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色